不同宿主生殖道的弯曲菌流行病学及其分离株分子特征分析

发布时间：2020-09-15 21:36

　　 弯曲菌(Campylobacter)是全球范围内最重要的人兽共患病原菌之一。人类弯曲菌感染轻则引起急性胃肠炎,严重时还会导致多种并发症。在反刍动物中,胎儿弯曲菌胎儿亚种(Campylobacter fetus subsp.fetus,C.ff)和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,Cj)多引起羊散发性流产和地方流行性流产,胎儿弯曲菌性病亚种(Campylobacter fetus subsp.venerealis,C.fv)作为牛生殖道弯曲菌病病原,则引起不育、胚胎早期死亡及流产,给畜牧业造成严重的经济损失。已有研究表明胎儿弯曲菌性病亚种能在牛生殖道定植,常通过人工授精或动物交配途径引起弯曲菌感染,但对于其他种或亚种的弯曲菌是否存在于牛或其他宿主的生殖道鲜有文献报道。因此明晰弯曲菌在生殖道中的流行状况和传播规律,对于人和动物弯曲菌病的防控具有重要意义。本研究首先建立了胎儿弯曲菌PCR检测方法,并结合现有的弯曲菌分离鉴定方法,对来自人、猴、牛和羊4种宿主的生殖道样品进行弯曲菌的分离鉴定,初步分析国内灵长类和反刍类动物生殖道弯曲菌的流行分布规律:对生殖道弯曲菌分离株的牛物学特性进行研究,并从基因组水平分析来自生殖道的弯曲菌分离株与肠道弯曲菌分离株的差异,从而为人和动物生殖道中弯曲菌的预防和控制提供数据支持。一、胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立及其初步应用以胎儿弯曲菌表面蛋白基因sapB2为靶基因,应用软件设计引物,通过反应条件的优化,引物敏感性、特异性和灵敏度的试验以及模拟污染样品的检测,建立胎儿弯曲菌PCR快速检测方法并应用于临床样品检测。结果显示本研究建立的PCR方法能特异性扩增胎儿弯曲菌sapB2(789 bp)基因片段,空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌以及其他17株参考菌如大肠杆菌、沙门菌等均未扩增出条带;胎儿弯曲菌纯培养物最低可检出0.23 pg/μL的DNA,模拟感染样品污水和奶牛粪便样品中胎儿弯曲菌的最低检出量分别为0.9 CFU/mL和20 CFU/g;临床样品检测中,该PCR方法与传统平板分离法对400份奶牛肛门擦拭样和125份产妇阴道擦拭样的检测结果一致且均为胎儿弯曲菌阴性,两类样品的对照组样品中,PCR方法的胎儿弯曲菌回收率均为100%,奶牛肛门擦拭样品平板分离法回收率为80%,产妇阴道擦拭样平板分离法回收率为100%。本研究所建立的胎儿弯曲菌PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、简便快速等特点,为胎儿弯曲菌的快速检测提供了技术支持,对识别该菌株的爆发流行,相关疾病的诊断和控制具有重要意义。二、不同宿主生殖道的弯曲菌流行病学调查于2017年3月至2018年6月期间,于扬州市某医院采集1128名孕妇的生殖道擦拭样及肛拭样,包括269例流产病例,收集其流产胎盘269份;于苏州和上海采集101只母猴的生殖道擦拭样及肛拭样;于扬州市某奶牛场采集455头健康奶牛和17头牛流产奶牛的生殖道擦拭样及肛拭样,采集流产奶牛胎盘及死胎的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和胃内容物;于江苏省的海安、盐城、盱眙、江都和涟水采集368头母羊的生殖擦拭样和肛拭样,及225份环境样。共采集了 2126份生殖道样品、2126份肛拭样及225份环境样。弯曲菌的分离鉴定结果显示,从人、猴、牛和羊的生殖道样中共分离到7株空肠弯曲菌、2株结肠弯曲菌、1株唾液弯曲菌及1株豚肠弯曲菌,所有样品均未分离到胎儿弯曲菌。其中空肠弯曲菌能从4种宿主的生殖道中被分离到,结肠弯曲菌在猴和羊的生殖道中被分离到,唾液弯曲菌和豚肠弯曲菌仅在牛的生殖道中被分离到。医院采集的孕妇生殖道样品中分离到1株弯曲菌且为空肠弯曲菌,阳性率为0.09%,肛拭样共分离到2株弯曲菌,总阳性率为0.18%,生殖道样和肛拭样弯曲菌阳性率无显著性差异(P0.05);健康孕妇和流产个体生殖道弯曲菌分离率分别为0.12%和0,无显著性差异(P0.05);流产个体和健康个体的肛拭样弯曲菌分离率分别为0.37%和0.12%,无显著性差异(P0.05);269份胎盘样品未分离到弯曲菌。猴源生殖道擦拭样及肛拭样分别分离到3株和24株弯曲菌,总阳性率为2.57%和20.69%,生殖道样的弯曲菌阳性率显著低于肛拭样(P0.05);母猴生殖道样分离到空肠弯曲菌2株,阳性率为1.72%,结肠弯曲菌1株,阳性率为0.86%;肛拭样中分离到空肠弯曲菌6株,阳性率为5.17%,结肠弯曲菌14株,阳性率为12.07%,其他弯曲菌属4株,阳性率为3.45%。116只母猴来自两种不同养殖模式,大笼群养和独笼养殖母猴生殖道样品弯曲菌总阳性率分别为3.16%和0,肛拭样弯曲菌总阳性率分别为24.21%和4.76%,大笼群养模式的母猴生殖道和肠道弯曲菌阳性率均显著高于独笼养殖模式(P0.05)。羊源生殖道样和肛拭样的弯曲菌总阳性率分别为0.73%和13.41%,生殖道样的弯曲菌阳性率显著低于肛拭样(P0.05)。410份母羊生殖道样品共分离到2株空肠弯曲菌和1株结肠弯曲菌,阳性率分别为0.49%和0.24%。6周内4次追踪采样一母羊群,正常饲养组和被接种李斯特菌组的生殖道样品均未分离到弯曲菌,正常饲养组肛拭样弯曲菌总阳性率从90.00%持续下降至37.50%,被接种李斯特菌组肛拭样弯曲菌总阳性率分别为100.00%、100.00%、88.89%和88.89%,连续6周处于一个较高的弯曲菌阳性水平。分群饲养的母羊群和公母混养的羊群生殖道样品弯曲菌分离率分别为0和1.48%,肛拭样弯曲菌分离率分别为0.97%和26.11%,差异显著(P0.05)。羊源正常散养的羊群和经过长途运输羊群的生殖道样品弯曲菌分离率分别为1.61%和0,肛拭样弯曲菌分离率分别为25.81%和95.00%,长途运输后的羊群肛拭样弯曲菌分离率显著高于正常散养的羊群(P0.05),但其生殖道弯曲菌分离率并未升高。牛源455头健康奶牛和17头牛流产奶牛的生殖道样弯曲菌阳性率分别为0.88%和0,均处于一个较低的感染水平,其中455头健康奶牛生殖道样品中分离到2株空肠弯曲菌、1株唾液弯曲菌和1株豚肠弯曲菌,分离率分别为0.44%、0.22%和0.22%。17头牛流产奶牛的生殖道擦拭样、胎盘及死胎脏器样品中均未分离到弯曲菌。健康奶牛和流产奶牛肛拭样弯曲菌阳性率分别为3.74%和5.88%,无显著性差异(P0.05)。三、生殖道弯曲菌分离株生物学特性及分子特征分析为了探究来自生殖道的弯曲菌分离株与其他生态位如肠道的弯曲菌分离株是否存在差异,我们对弯曲菌分离株的运动力、趋化性等生物学特性进行了研究,并通过全基因组测序手段,对来自生殖道和肠道的弯曲菌分离株进行了基因组的比较分析。运动力实验结果从菌种水平上分析,生殖道空肠弯曲菌分离株与肛拭样分离株的运动力平均直径分别为4.94 cm和5.05 cm,无明显差异,而结肠弯曲菌和唾液弯曲菌的运动力平均直径均大于肛拭样分离株。乳酸耐受能力从菌种水平上分析,生殖道空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和唾液弯曲菌分离株的乳酸耐受能力均强于肛拭样分离株,其在乳酸MH溶液中于37℃下作用8 min后的平均减少量分别为1.53、1.49、1.10个数量级和1.60、1.93、2.15个数量级。硬琼脂法进行趋化性分析,从菌种水平上看来,生殖道空肠弯曲菌分离株在趋化物DL-苹果酸和丁二酸中均表现出比肛拭样分离株更强的趋化性;生殖道结肠弯曲菌分离株在三种趋化物中均表现出比肛拭样分离株更强的趋化性;生殖道唾液弯曲菌分离株在α-酮戊二酸和丁二酸中均表现出比肛拭样分离株更强的趋化性。细胞黏附侵袭从菌种水平上来看,生殖道空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和唾液弯曲菌分离株对Caco-2细胞和CHO细胞的黏附和侵袭能力均强于肛拭样分离株,且对CHO细胞的黏附和侵袭能力强于Caco-2细胞。从整体水平上看来,大多数情况下生殖道弯曲菌分离株在运动力、乳酸耐受能力、趋化性以及对Caco-2和CHO两种细胞的黏附侵袭能力上均强于肛拭样分离株。因此我们推测,这些能在生殖道中生存的弯曲菌在某些生物学特性上存在一定的优势,使其能够生殖道这种存在胁迫因子的恶劣环境中得以生存。进行进化关系分析显示,生殖道弯曲菌分离株与肛拭样分离株程交叉分布。生殖道弯曲菌分离株与肛拭样弯曲菌分离株在CDS数量上没有明显差异。生殖道弯曲菌分离株基因组的总碱基数量和平均GC(%)含量均低于肛拭样分离株,可能与适应性进化有关。MLST分析显示,生殖道弯曲菌分离株与肛拭样分离株有3个同源复合体类型(ST-21,ST-22,ST-828)相同,表明宿主生殖道中感染的弯曲菌的同源复合体类型并不是特异的;生殖道弯曲菌分离株与肛拭样分离株有2个ST型(2和4253)相同,说明宿主生殖道中感染的弯曲菌ST型并不是特异的。细菌基因组的11类毒力基因数量统计分析结果显示,生殖道弯曲菌分离株与肛拭样弯曲菌分离株之间并未发现明显的差异和规律。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R535
【部分图文】：

图３＊４分离株对Ｃａｃｏ－２细胞和ＣＨＯ细胞的相对黏附、侵袭率逡逑Ｆｉｇ邋３－邋４邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ａｄｈｅｓｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｉｎｖａｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｃａｃｏ－２邋ａｎｄ邋ＣＨＯ邋ｂｙ邋Ｃａｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ逡逑Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ分别是空肠弯曲菌对Ｃａｃｏ－２细胞和ＣＨＯ细胞的相对黏附、侵袭率结果图；Ｅ、Ｆ、逡逑Ｇ、和Ｈ是结肠弯曲菌对Ｃａｃｏ－２细胞和ＣＨＯ细胞的相对黏附、侵袭率结果图；Ｉ、Ｊ、Ｋ和Ｌ分别逡逑是唾液弯曲菌对Ｃａｃｏ－２细胞和ＣＨＯ细胞的相对黏附、侵袭率结果图；Ｍ、Ｎ和０分别是空肠弯逡逑曲菌、结肠弯曲菌和唾液弯曲菌对Ｃａｃｏ－２细胞和ＣＨＯ细胞的相对黏附、侵袭率的整体水平分布情逡逑况逡逑

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本文编号：2819497