RNAi工程微藻防控登革热传毒媒介伊蚊的研究

发布时间：2020-09-29 06:27

　　以登革热为代表的蚊媒传病已经成为十分重要而且紧急的世界性公共卫生问题。据统计,全球每年约有一半的人有感染此类疾病的危险。伊蚊是传播登革热的主要媒介。登革热主要有四个血清型病毒,由于目前还没有有效的疫苗来预防感染,因此通过切断传播途径来防治登革热的传播至关重要。现今主要是通过物理方法和化学方法来消灭媒介蚊虫,但是对环境会造成不可逆的污染,对非目标物种也会造成一定程度的损伤,且逐步增加蚊虫的抗药性。因此,急需一种对环境友好,对生态可持续发展的有效生物策略来防控蚊媒疾病的传播。RNAi作为一种反向遗传工具,能够对目的基因进行敲除,以实现基因表达的负调控功能。HR3(孤儿核受体,Hormone receptor 3)在昆虫生殖发育过程中起着重要的作用,参与卵母细胞的成熟及雌性伊蚊产卵过程,同时调节蜕皮和昆虫蛹的形成,若敲除该基因,则将导致昆虫不能进行正常蜕皮,幼虫迅速死亡。羟基犬尿素(3-HK)是伊蚊体内高活性的中间体,容易氧化生成大量的活性氧,导致伊蚊死亡。3HKT(羟基犬尿氨酸转氨酶,3-hydroxykynurenine Transaminase)催化3-HK转化为黄尿烯酸,阻断该活性氧产生途径,有利于伊蚊正常生长发育。目的:编码HR3和3HKT两个蛋白的基因做为RNAi靶基因,在衣藻中表达后饲喂伊蚊幼虫,作用于伊蚊幼虫体内HR3和3HKT基因,降低其表达水平,从而确定工程藻株对伊蚊的致死作用,为生物灭蚊打下基础,达到生物防治登革热的目的。方法:对伊蚊的HR3和3HKT两个基因进行克隆,构建RNAi表达载体,将其转化进莱茵衣藻CC425藻株,喂食埃及伊蚊幼虫。对伊蚊幼虫进行生物学检测,细胞组织观察,RNA水平检验,确定转基因工程藻株灭蚊效果。结果:生物学观察,喂食HR3和3HKT转基因藻株的幼虫较对照组幼虫生长显著缓慢。饲喂转基因藻株的幼虫在第20小时就有死亡现象发生,并且喂食3HKT转基因藻株的幼虫较喂食HR3转基因藻株的幼虫死亡更为迅速。病理组织切片观察,喂食转基因衣藻的幼虫在表皮、中肠等部位均出现了不同程度的破坏。RNA水平检测,喂食转基因藻株的幼虫其靶基因表达水平均出现了不同程度的下降。结论:RNAi转基因藻株在伊蚊幼虫体内发生RNA干扰作用,降低HR3和3HKT的表达水平,最终阻碍伊蚊的生长发育进程,导致伊蚊幼虫的死亡。本研究为生物策略防控蚊媒传病提供了一定的技术途径和方法,为大规模防控蚊媒疾病贡献了新的思路。
【学位单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R512.8;R184.3
【部分图文】：

核酸序列,多序列比对,核酸序列,保守区

图 1.2 HR3 蛋白保守区域多序列比对Figure. 1.2 Multi-sequence comparison of conserved region of HR3 protein利用 ProtParam 对 HR3 核酸序列进行分析（表 1.1），HR3 蛋白质分子式为 C2341H3700N640O722S32，理论分子量为 53388.91，等电点为 5.66，半衰期为 30小时，不稳定参数为 50.99，为不稳定蛋白。组成蛋白质的氨基酸数量为 468，主要的氨基酸为：丝氨酸 Ser（41 个，占 8.8%），亮氨酸 Leu（41 个，占 8.8%），谷氨酸 Glu（32 个，占 6.8%），缬氨酸 Val（29 个，占 6.2%），天冬氨酸 Asp（29 个，占 6.2%），谷氨酰胺 Gln（28 个，占 6.0%），异亮氨酸 Ile（28 个，占 6.0%），丙氨酸 Ala（26 个，占 5.6%），苏氨酸 Thr（26 个，占 5.6%），精氨酸 Arg（26 个，占 5.6%），赖氨酸 Lys（25 个，占 5.3%），甘氨酸 Gly（22 个，占 4.7%），甲硫氨酸 Met（21 个，占 4.5%），苯丙氨酸 Phe（19 个，占 4.1%），酪氨酸 Tyr（19 个，占 4.1%），酪氨酸 Tyr（19 个，占 4.1%），

序列,基因系统,内含子,比例尺

图 1.3 HR3 跨膜结构域分析Figure. 1-3 Cross-membrane domain analysis of HR3（2）昆虫 HR3 基因系统发育树HR3 基因系统发育树，总结了 HR3 基因家族的进化关系。从 GenBank 中搜索到 15 种相关昆虫的 HR3 序列，通过 MEGA7 软件构建了系统发育树（图1.4.A）。从进化树中可以看出，埃及伊蚊 HR3 基因序列与白纹伊蚊及其相似，同源率达到 99%，其次是蝇属，与玉带凤蝶的同源性最差，同源率只有 71%。利用在线工具 GSDS 绘制基因结构，如图 1.4.B 所示，外显子和内含子分别用黄色矩形和细线表示，未翻译的区域（UTRs）用蓝色框表示，底部比例尺估计外显子和内含子的大小。HR3 蛋白质结构域利用在线工具 Smart 和 Pfam 共同得出。不同的域用不同颜色的框表示，标志在右下角，借助底部的比例尺可以明确蛋白质的结构和大小（图 1.4.C）。

核酸序列,核酸序列,保守区,多序列比对

12图 1.6 3HKT 蛋白保守区域Figure. 1.6 Multi-sequence comparison of 3H利用 ProtParam 对 3HKT 核酸序列进行分式为 C1935H3039N519O554S25，理论分子量为 43230 小时，不稳定参数为 38.63，为不稳定蛋白。主要的氨基酸为：亮氨酸 Leu（37 个，占 9.5%）异亮氨酸 Ile（29 个，占 7.5%），丙氨酸 Ala（24 个，占 6.2%），脯氨酸 Pro（24 个，占6.2%），缬氨酸 Val（24 个，占 6.2%），精氨氨酸 Lys（19 个，占 4.9%），天冬氨酸 Asp（（17 个，占 4.4%），天冬酰胺 Asn（15 个，占

【相似文献】