博尔纳病病毒诱导的H3K9乙酰化水平下降所致认知障碍的机制研究

发布时间：2020-10-25 04:31

　　 背景博尔纳病病毒(BDV)是一种非节段单股负链RNA病毒,具有较强的嗜神经特性。BDV感染的动物种类十分广泛,从啮齿动物到灵长类动物,还包括人类。BDV感染新生期啮齿动物的海马和边缘叶,导致认知缺陷和精神行为异常,其症状与人类认知和情感障碍比较类似。虽然BDV和人类之间有着密切的关系,但BDV在认知障碍中发挥的作用仍然不清楚。有研究证明了表观遗传学(Epigenetic),特别是组蛋白乙酰化,在介导染色质重塑和海马依赖的认知功能中起着关键作用,而记忆形成的关键是依赖突触功能的可塑性,说明记忆和突触可塑性密切相关,然而,BDV是否通过表观遗传学来影响突触可塑性进而导致认知功能障碍目前还不得而知。组蛋白乙酰转移酶(HATs)或组蛋白去乙酰酶(HDACs)在调节组蛋白乙酰化水平上起着决定性作用,任何酶活性异常都可以改变乙酰化组蛋白水平,并引起异常基因表达。辛二酰苯胺氧肟酸(SAHA)是HDAC抑制剂,已被证实其靶向抑制HDAC I类和IIb类,最终引起组蛋白乙酰化上调。经SAHA治疗可以增强大鼠和小鼠的记忆形成能力,并在动物模型中改善了神经退行性疾病所致的记忆缺陷,而且已证明在皮层神经元和海马神经元实验室BDV株感染能影响特异位点组蛋白乙酰化,在此基础上,研究BDV通过表观遗传学致使认知障碍和SAHA能够改善记忆能力可能的机制有着重要的意义。目的1.观察BDV感染大鼠海马神经元细胞后组蛋白乙酰化和突触可塑性的表达水平,探讨BDV在神经元细胞中产生的影响。2.观察BDV感染大鼠海马组织后,大鼠的认知能力以及组蛋白乙酰化和突触可塑性的改变,探讨BDV对大鼠认知功能的影响和相关的机制。3.探讨经SAHA作用后,细胞和动物水平发生的改变以及相关的机制。方法1.采用免疫荧光方法检测BDV在细胞和动物组织内的感染情况。2.通过ChIP-seq方法找出与H3K9ac相互作用的突触可塑性基因,并用RT-qPCR技术在mRNA水平检测突触可塑性基因的表达。3.利用Western blotting技术检测组蛋白乙酰化和突触可塑性蛋白的表达。4.水迷宫用于评价大鼠认知能力。5.采用高尔基染色方法对海马神经元树突分支和树突棘密度进行检测。6.利用脑片膜片钳技术评价大鼠LTP。结果1.免疫荧光结果显示无论是细胞还是动物体内,BDV都能充分感染,而正常对照组则不受BDV影响。2.利用Western blotting技术找到了BDV引起组蛋白乙酰化的关键位点——H3K9ac,而ChIP-seq方法找出了与H3K9ac相互作用的突触可塑性基因——PSD95、BDNF、PUM2、VAMP2、SYN1和DRD1。RT-qPCR和Western blotting发现BDV致使PSD95、BDNF、PUM2、VAMP2、SYN1显著下调,SAHA能逆转PSD95、BDNF的表达水平且细胞和组织的验证具有一致性。3.水迷宫实验发现BDV可诱导大鼠认知功能障碍,BDV组大鼠穿过平台所在象限的次数明显比CON组少(4.14±0.38 vs 6.50±0.62s,P0.05),而经过SAHA治疗后,BDV+SAHA组能显著逆转(6.79±0.65 vs 4.14±0.38s,P0.05),大鼠的认知障碍有所改善。4.通过对高尔基进行染色,发现BDV能致使海马神经元树突分支和树突棘密度显著降低,但是SAHA能减轻BDV产生的影响。5.最后通过膜片钳检测LTP,CON组,BDV组和BDV+SAHA组的基线没有差异,HFS能稳定诱导CON组脑片LTP并能维持1h以上(CON:n=8,159.1±7.6%),而BDV组大鼠fEPSP波形的斜率明显下降,LTP诱导明显受损(BDV:n=6,133.9±6.4%,P0.01),在SAHA干预后,BDV所致的LTP受损情况明显得到逆转(BDV+SAHA:n=7,155.2±7.3%,P0.01)。结论1.BDV感染大鼠海马神经元细胞后,H3K9ac和突触可塑性基因与蛋白的表达显著降低,BDV通过抑制突触可塑性基因TSS的H3K9ac水平来降低突触可塑性蛋白的表达。2.BDV感染大鼠海马组织后,大鼠的认知能力与H3K9ac介导的突触可塑性的改变具有相关性,说明BDV主要通过降低H3K9ac损伤大鼠认知功能。3.SAHA能逆转细胞和动物乙酰化水平,并改善BDV所致的大鼠认知功能障碍。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R511;R749.2
【部分图文】：

图 1. ChIP-seq 实验筛选与突触可塑性关联的基因 （A）ChIP 具体流程；（B）高通量测序流程。Figure 1. ChIP-seq experimental screening associated with synaptic plasticity gene; (A) ChIspecific process; (B) High throughput sequencing process.1.2.10 SAHA 处理海马神经元细胞对于已经感染 BDV 的海马神经元细胞加入 SAHA 处理。在神经元细胞感染BDV 8 天时，向培养皿中加入 1μl 10μM SAHA，轻轻摇匀后放入培养箱 24h。1.2.11 海马神经元细胞 RNA 提取与逆转录本实验采用 Trizol 法对三组神经元细胞即未感染组（CON 组）、感染组（BD组）和感染后 SAHA 处理组（BDV+SAHA 组）的细胞 RNA 进行提取，具体操作如下：A. 弃去培养液，PBS 洗涤 2 次，加入 1ml Trizol，用细胞刮子将细胞刮下后

C. 诱导 LTP：采用 100Hz 的高频刺激（HPS）诱导 LTP，产生 LTP 后持续 60min，统计其波形斜率相对于基线改变的百分比。.2.19 数据统计分析数据均采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，并以平均值 标准误（mean SE示。采用独立样本 t 检验或单因素 ANOVA 统计分析，P < 0.05 表示有统计学。 结果.1 海马神经元感染率和纯度P24 蛋白是 BDV 主要表达蛋白之一，而神经元又能特异性表达 Map2 蛋白过免疫荧光实验可以检测 P24 和 Map2 蛋白的表达，进而检测 BDV 对神经元染率和神经元纯度，图 2 为免疫荧光结果。

重庆医科大学硕士研究生学位论文为了研究 BDV 感染神经元后对组蛋白乙酰化位点的影响，采用 Westerblotting 进行检测。结果显示，BDV 感染后 H3K9ac 比对照组下调了 41.81%，P 0.01（图 3），而其他位点如 H2BK5ac，H2BK20ac，H3K14ac，和 H4K16ac 两组之间没有显著差异，P > 0.05。因此，针对 H3K9 ac 这个关键位点进行后续研究
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本文编号：2855464