研究背景和目的:干扰素α是目前广泛用于临床的一线抗乙肝病毒药物,它具有广谱性、高活性、间接性及种属特异性等特点的抗病毒效应。它是一种具有抗病毒作用的细胞因子,干扰素自身不能直接使病毒灭活,而往往是通过激活JAK-STAT信号转导通路发挥其抗病毒效应。研究表明,I型干扰素(IFN-α、IFN-β)通过与其特异性的干扰素受体(IFNAR)结合后,激活JAK激酶-JAK1、Tyk2,继而招募有SH2结构域的STAT1和STAT2(信号转导和转录活化因子),并使之磷酸化,激活的STAT1、2异源性二聚体与IRF-9(IFN调节因子9)结合,再结合上ISGF3γ组成ISGF3(IFN刺激基因因子3复合体),ISGF3从细胞质转位到细胞核与干扰素刺激应答元件(ISRE)结合,启动后者转录,激活蛋白激酶(PKR)等一系列调控抗病毒靶基因的转录,诱导多种抗病毒蛋白的表达,最主要的抗病毒蛋白有PKR与核糖核酸酶L(RNase L),它们分别通过影响病毒mRNA的翻译与降解RNA起抗病毒作用。干扰素α同时还具有抗肿瘤、免疫调节等作用。持续性的乙型肝炎病毒感染是引起原发性肝癌的主要原因。在HBV相关原发性肝癌的发生发展过程中乙肝病毒X蛋白(HBx)起十分关键的作用,它可以作为原癌基因或者共同作用因子促进肿瘤的发生。本研究目的是建立HBV相关的肝癌细胞模型,即转染携带HBx基因慢病毒的人肝癌细胞Huh-7细胞,观察干扰素α对该细胞模型细胞行为学和JAK-STAT信号通路相关分子表达的影响,从肝癌细胞生物学行为角度及干扰素α主要作用的JAK-STAT信号通路上重要分子(IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNAse L)的表达水平来分析探讨干扰素α抑制HBV相关HCC的机制。同时设计使用干扰素α抗病毒治疗的慢性乙肝患者临床试验,检测各治疗节点有效组及无效组患者之间上述5个分子表达水平差异,以期寻找能早期判断干扰素α应答效果的因子。方法:1、构建携带乙肝病毒X基因的慢病毒载体,转染肝癌细胞Huh-7,采用免疫荧光进行鉴定;再以MTT法检测细胞增殖活性,划痕实验检测细胞迁移能力,侵袭实验检测细胞侵袭能力;之后将Huh-7和Huh-7-HBV X再加入干扰素α干预,观察干扰素α对上述细胞模型生物学行为的影响。2、同样选择肝癌细胞Huh-7为对照,转染携带HBV X基因的慢病毒载体形成Huh-7-HBx,之后将Huh-7和Huh-7-HBV X再加入干扰素α干预;自干扰素作用环节的始动环节起分别用RT-qPCR和Western-blot检测JAK-STAT通路重要相关分子即干扰素受体(IFNAR1、IFNAR2)干扰素刺激基因因子3(ISGF3)、RNA依赖蛋白激酶(PKR)、核糖核酸酶(RNase L)的mRNA和蛋白表达水平的变化。3、收集在南昌大学第一附属医院感染科就诊的符合干扰素α治疗指征的慢性乙型肝炎患者,入组患者给予聚乙二醇IFNα-2b,1.0μg/kg/周,每周1次,皮下注射,或普通IFN-α,500万U,隔日一次,皮下注射。疗程48周,治疗24周仍无应答者作无效病例停药。收集基线(治疗前)、治疗4周、8周、12周、24周时的PBMCs。所有患者在治疗24周疗程结束时判断疗效,依据疗效分为两组:(1)有效组:ALT正常,HBV-DNA500IU/m L或下降幅度≥2log IU/m L,HBeAg发生或未发生血清学转换;(2)无效组:ALT正常或升高,HBV-DNA下降幅度2log IU/mL,HBe Ag未发生血清学转换。分别采用RT-qPCR法和Western blot法检测各治疗时间点PBMCs中JAK-STAT通路各分子IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase-L的mRNA表达水平和蛋白表达水平。结果:1、Huh-7细胞经HBX修饰后迁移和侵袭能力部分增强,而经IFN-α干预后Huh-7细胞和Huh-7转染组细胞迁移和侵袭能力均有所减弱,差异均有统计学意义(P0.05)。Huh-7经HBX修饰后增殖能力无明显影响,同时经IFN-α干预后Huh-7和Huh-7转染组细胞增殖能力亦无明显影响(P0.5)。2、经慢病毒转染后Huh-7细胞中HBX基因显著高于转染前(P0.05)。经IFN-α干预后Huh-7细胞IFNAR2、ISGF3、PKR、RNaseL基因表达均出现了上调,差异均有统计学意义(P0.05)。而经IFN-α干扰后Huh-7-HBx转染组细胞IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase L基因表达亦均出现了上调,且上调水平高于Huh-7细胞组,差异均有统计学意义(P0.05)。经慢病毒转染后Huh-7细胞HBX蛋白显著高于转染前(P0.05)。经干扰素α干预后Huh-7细胞和Huh-7-HBx细胞上述5个分子的蛋白表达水平变化呈现与mRNA表达水平基本一致的结果,差异均有统计学意义(P0.05)。3、共入选41例患者,包括30名男性及11名女性,18例患者接受PegIFNα-2b,1.5μg/Kg,每周1次;23名患者接受普通IFNα-2b,500万单位,每周3次,所有患者完成24周治疗。24周治疗结束,依据上述分组标准,在41名患者中25名患者为治疗有效组(A组),16名为治疗无效组(B组)。治疗基线、4周、8周、12周和24周时,IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNASE-L的mRNA表达水平组间差异均有统计学意义,且均为A组B组。治疗4周时,IFNAR2及PKR的mRNA水平治疗有效组显著高于无效组,在治疗8周时IFNR1及ISGF3的水平有效组显著高于无效组,而Western-blot检测显示的上述蛋白水平也呈现基本一致的结果。结论:1.HBx可增加肝癌细胞Huh-7的体外迁移和侵袭能力,但对增殖能力无明显影响;IFNα可抑制肝癌细胞Huh-7和Huh-7-HBx转染组细胞的迁移和侵袭能力,但对增殖能力亦无明显影响。2.干扰素α可上调肝癌细胞Huh-7中JAK-STAT通路分子IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase L基因以及蛋白的表达水平,而干扰素α干预后Huh-7-HBx转染组细胞IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNaseL基因和蛋白表达亦均出现了上调,且上调水平高于Huh-7细胞组。提示干扰素α抗HBV相关性肝癌可能与其上调上述抗病毒蛋白有关。3.JAK-STAT通路分子IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNAse-L为干扰素α抗病毒作用的重要分子,上述5个分子的mRNA以及蛋白的组间和时间点差异性表达可能是影响IFNα抗病毒效应的重要机制。从早期预测干扰素α治疗慢性乙肝应答价值的角度来看,IFNAR2及PKR有望成为早期预测干扰素应答的指标。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：
携带乙肝病毒X基因慢病毒载体阳性克隆鉴定
Huh-7肝癌细胞转染慢病毒白光照片
Huh-7肝癌细胞转染慢病毒绿色荧光照片
【参考文献】
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