乙型肝炎病毒X基因突变与自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B和P62）对肝细胞癌作用的相关性研究

发布时间：2020-10-30 19:30

　　 目的:通过分析HBV相关HCC患者的癌及癌旁组织中HBX突变特征,同时检测自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3B和P62)表达情况评定HCC组织中自噬活性,并在以上基础上探索HBX突变致HCC的过程中是否与自噬有关,以期为HBX致肝癌作用机制提供实验基础。方法:以HBV相关的HCC患者为研究对象,收集2015年7月1日~2016年12月30日广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科因HCC手术切除的HCC患者,取其HCC组织及对应癌旁组织(取自距手术切缘大于2cm),同时收集患者临床资料。采用巢式PCR方法扩增HBX基因序列,对纯化后产物应用Sanger测序法测定肝癌与癌旁组织中HBX突变类型;免疫组织化学法检测肝癌及癌旁组织中自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3B及P62)的表达情况;运用SPSS22.0软件包分析数据。对所有定量数据进行正态性检验,配对t检验分析癌与癌旁组织间蛋白均值差异;自噬蛋白表达与临床病理因素间关系采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析,组内两两比较用LSD-t检验;计数资料率与构成比的比较用χ~2检验;Pearson相关分析自噬蛋白表达的相关性;Sperman相关分析HBX突变与自噬蛋白表达间的相关关系;P0.05为差异有统计学意义(双侧)。结果:1.HBX基因羧基端序列缺失情况癌组织中,HBX羧基端序列缺失率为25.0%(15/60),高于癌旁组织6.7%(4/60),差异有统计学意义(χ~2=7.566,P=0.006);癌组织HBX羧基端序列缺失长度范围为(6~31)bp,癌旁组织羧基端缺失长度范围为(9~25)bp。2.HBX基因插入突变情况插入突变存在于肝癌组织的6条序列和癌旁组织的3条序列中,分布差异无统计学意义(P0.05),但特殊的是插入突变序列中均存在AFP20ng/ml,另外发生插入突变序列中有89%序列的位于HBX羧基端;3.HBX基因点突变情况本研究发现的热点氨基酸点突变,癌与癌旁组织中均存在,并非某一组织所特有;非差异性热点突变中,S78R、P152T突变检出率均在90%左右,是所有突变中检出率较高的热点突变;癌组织第47、118、130、131、130+131、132、143、30+144位氨基酸点突变率分别为53.6%、32.1%、78.6%、78.6%、76.8%、30.4%、28.6%、12.5%,高于癌旁组织的33.9%、14.3%、58.9%、58.9%、55.4%、10.7%、12.5%、1.8%,差异均有统计学意义(P均0.05),其余热点突变在癌与癌旁组织中间的检出率的差异无统计学意义(P0.05);4.差异性点突变对蛋白结构影响分析本研究提示的6个统计学差异的突变位点均位于HBX羧基端且其中5个位于EnhII(K118T)或BCP(K130M、V131I、F132Y/E、C143R/H)区域;A47T位于重要的T_B细胞表位;K118T、K130M、V131I、F132Y/E位于重要的T_H细胞表位(aa111-135);K130M、V131I、F132Y/E突变位点T_C细胞表位(aa126-134)之中;5.Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中的表达情况Beclin-1、LC3B及P62蛋白主要定位于细胞质中,为黄色、棕黄色染色颗粒,弥漫分布。与癌旁组织相比,癌组织Beclin-1、LC3B蛋白表达量降低,而P62蛋白表达量增加,差异均有统计学意义(P0.05);6.Beclin-1、LC3B及P62蛋白表达与临床病理特征的关系Beclin-1蛋白表达水平与肿瘤大小有关联(F=3.474,P=0.030);LC3B蛋白表达水平与BCLC分期(A/B)有关联(t=5.960,P0.0001);P62蛋白表达水平与Edmondson分级,癌栓存在情况有关联(F=4.274,t=2.459,P均0.05);与其它临床病理特征差异均无统计学意义(P0.05)。7.HBX突变与Beclin-1、LC3B及P62蛋白的相关性分析根据上述检测HBX突变体的实验结果,同时结合前期本课题组血清学实验结果及其他课题组研究成果,筛选出几个不同的HBX基因突变体,分别是羧基端缺失情况、V30L、A47T、V88N/D、K118T、K130M、V131I、F132Y/E、C143R/H、S144Y、V30L+S144Y、K130M+V131I、三联突变K130M+V131I+F132Y/E、三联突变K130M+V131I+C143R/H;相关分析结果显示:癌组织中,F132Y/E、V30L+S144Y双突变、K130M+V131I+F132Y/E三联突变与LC3B呈现正相关(r_s=0.278、0.279、0.278,P均0.05);而在癌旁组织中,A47T与LC3B呈正相关(r_s=0.270.270,P=0.045);K118T氨基酸位点突变与Beclin-1蛋白的表达呈现负相关,分别是(r_s=-0.325,P=0.014),其余HBX突变未见与Beclin-1、LC3B及P62蛋白表达有相关性(P0.05)。8.Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中表达的相关性分析癌旁组织中,Beclin-1和LC3B的表达呈正相关(r=0.416,P=0.001);Beclin-1和P62的表达呈正相关(r=0.361,P=0.006);LC3B和P62的表达无明显相关性(P0.05)。癌组织中,Beclin-1、LC3B及P62的间均无明显相关性(P0.05)。结论:1.HBX突变具有多态性;2.尽管HBX序列中点突变数量众多,但仅有部分点突变对HCC发生有影响;3.自噬活性降低可能与HCC的发生发展有关;4.HBX F132Y/E、V30L+S144Y双突变、K130M+V131I+F132Y/E三联突变可能与自噬延长过程有影响,这可能与HCC的发生发展进程有关。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R735.7;R512.62
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
1.材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 研究对象
        1.1.2 研究标本处理
    1.2 伦理学说明
    1.3 本课题技术路线图
    1.4 实验仪器与试剂
        1.4.1 主要实验仪器
        1.4.2 主要实验试剂
    1.5 实验方法
        1.5.1 组织中HBV DNA的提取：实验操作严格按照实验说明书进行
        1.5.2 组织HBV DNA纯度测定
        1.5.3 巢式PCR扩增HBX基因
        1.5.4 琼脂糖凝胶电泳
        1.5.5 巢式PCR产物测序与结果分析
        1.5.6 石蜡包埋切片
        1.5.7 免疫组织化学法操作步骤
        1.5.8 免疫组化结果判定
    1.6 统计学方法
2.结果
    2.1 研究对象的临床特征
    2.2 HBX基因扩增分析
    2.3 HBX基因测序峰图
    2.4 HBX基因突变分析
        2.4.1 HBX序列多重对比情况
        2.4.2 HBX基因羧基端序列缺失情况
        2.4.3 HBX基因插入突变情况
        2.4.4 HBX基因点突变情况
        2.4.5 差异性点突变对蛋白结构的影响分析
    2.5 Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中的表达情况
    2.6 Beclin-1、LC3B和P62蛋白表达与临床病理特征的关系
    2.7 HBX突变与Beclin-1、LC3B及P62蛋白的相关性分析
    2.8 Beclin-1、LC3B及P62蛋白在癌与癌旁组织中表达的相关性分析
3.讨论
全文小结
参考文献
附录1 中英文缩略词一览表
综述 乙型肝炎病毒X蛋白与自噬在肝癌发生发展中作用 的研究进展
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文

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本文编号：2862908