背景及目的:肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤,也是全球癌症相关死亡的第四大原因。由于肝癌早期缺乏特异性的临床症状,且缺乏简便易行的筛查方法,许多肝癌患者在诊断时已进入晚期阶段。而相比于早期肝癌,晚期肝癌可获得的治疗方式有限,预后不良。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是中国人群肝癌发生的首要原因。为此,在慢性乙型肝炎或肝硬化人群中,定期、及早的筛查肝癌显得尤为必要。尿液相比较于血液具有无创、简便、易于操作的特点,是较为理想的生物标志物检测途径,此项研究旨在发掘HBV相关肝癌患者尿液中的新型诊断或筛查生物标志物,并评估其诊断肝癌的效能。目前临床上,运用最为广泛且最为认可的肝癌诊断标志物为甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP),然而AFP在HBV感染的肝癌细胞中的生物学功能尚不清楚,本研究将拟通过进一步的实验加以明确。方法:我们设计了发现队列(n=40)以及验证队列(n=140),收集尿液标本进行生物标志物的研究。其中发现队列包括四个组别:肝细胞癌组(肝癌组,10人),乙肝肝硬化组(肝硬化组,10人),慢性乙型病毒性肝炎组(慢乙肝组,10人)和健康对照组;验证队列包括3个组别:肝癌组(n=75,其中48例为新发肝癌,27例为肝癌术后患者)、肝硬化组(n=51)和慢乙肝组(n=14)。通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术联合高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)鉴定发现队列中肝癌与非肝癌人群的尿液差异表达蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs),然后使用组织特异性表达分析工具(Tissue specific expression analysis,TSEA)对这些尿DEPs进行组织来源分析,根据DEPs的变化倍数和一系列生物信息学方法(使用PANTHER数据库进行功能富集实验,使用STRING在线数据库构建蛋白质相互作用网络),找出下一步研究的目标蛋白。通过免疫印迹实验(Western blot)验证尿液中目标蛋白是否存在以及分子量大小。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定尿液中目标蛋白的浓度。为明确AFP在HBV感染的肝癌细胞中的生物学功能,我们通过转染靶向人AFP的shRNA慢病毒进入HepG2.2.15和HepGAD38细胞中,采用定量逆转录-聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测AFP的敲低效率,然后通过MTT评估细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,以及Transwell实验测定细胞侵袭和迁移。统计分析:两组目标蛋白的浓度比较采用非参数检验的Mann-Whitney U检验进行分析,使用Pearson相关系数以确定两个连续变量之间的相关性,使用受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线来分析评估目标尿蛋白诊断肝癌的效能,两者ROC曲线比较采用Delong检验,P值小于0.05被认为具有统计学意义。结果:通过蛋白质组学技术及分析,我们共鉴定出了96个肝癌尿DEPs,其中74个上调,22个尿蛋白下调。这些蛋白主要为分泌型蛋白,信号通路主要富集在血液凝固、CCKR信号通路、血纤维蛋白溶酶原激活级联反应。通过蛋白质相互作用网络分析,我们确定了15个关键蛋白,分别为:CP,FGA,AFP,CST3,TGOLN2,HSP90B1,VCAN,LTBP1,IGFBP7,ORM1,AMBP,FGB,ORM2,RBP4和CAMP,这些蛋白被认为在肝癌的发生发展中发挥着重要作用。另外,我们通过与既往血液蛋白质组学研究相比较,共有6个蛋白是血液和尿液中共有的,分别是:ORM1,LBP,ANPEP,GSN,AFP和SERPINA3,再整合变化倍数排前10位的DEPs,我们最终确定AFP和α1酸性糖蛋白(Orosomucoid 1,ORM1)作为我们后续的研究目标蛋白。Western blot实验证实尿液中确实存在AFP和ORM1蛋白,其对应的条带位置分别为70kd和45kd,与蛋白的实际分子量大小一致。通过对140例验证队列受试者尿液进行ELISA检测,我们再次验证了肝癌患者中存在相对较高浓度的u-AFP和u-ORM1。结果显示:肝癌组u-AFP水平[109.9(3,3308.9)pg/ml]明显高于肝硬化组[3(3,3)pg/ml,p=0.002]和肝炎组[3(3,3)pg/ml,p0.001]。u-AFP和血清AFP或AFP-L3存在强相关关系,皮尔森相关系数分别达0.673(p0.0001)和0.944(p0.0001),表明u-AFP可能来源于血液循环。肝癌组u-ORM1浓度[1370.6(522.2,10909.2)ng/ml]明显高于肝硬化组[574.6(320,1056.4)ng/ml,p0.001],但与肝炎组比较差异无统计学意义(p=0.286)。为评估两者的临床应用价值,我们分别绘制了ROC曲线,u-AFP的ROC曲线下面积(AUC)为0.795(95%CI:0.706-0.886),当设定诊断阈值为25.8pg/ml时,u-AFP诊断肝癌的敏感性为63.5%,特异性为95.4%。虽然u-ORM1诊断肝癌的效能较弱,其AUC为0.705(95%CI:0.604-0.807),但当联合u-AFP和u-ORM1时,其诊断效能明显提升,AUC达到0.864(95%CI:0.791-0.937),敏感性为80.9%,特异性为85.5%。另外,我们对u-AFP和u-ORM1做了定性诊断分析,设定u-AFP大于3pg/ml为阳性,u-ORM1大于1284.9ng/ml为阳性。结果显示:单独u-AFP的阳性预测值为90.9%,并行联合u-AFP和u-ORM1的诊断敏感性为85.1%,诊断效能较好,有望进一步开发为诊断试纸条。细胞功能实验表明,敲除AFP可显著抑制HBV感染细胞的增殖、侵袭和迁移。AFP敲低后,细胞上清液中的HBV-DNA下降了约50%,HBsAg无明显变化,而HBeAg上升了约20%,表明AFP对HBV-DNA的复制有明显的促进作用。AFP敲低促进了INFA1和下游基因的表达,包括OAS1,OAS2,ISG15和RNASEL。表明AFP有可能通过抑制IFNα信号通路促进HBV-DNA的复制,虽然这一结论需要得到更多实验的证实。结论:尿AFP是肝癌的潜在诊断或筛查生物标志物,联合尿ORM1可提高其诊断效能,并有希望开发为诊断试纸条。AFP可以促进HBV感染的肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并且可能通过抑制IFNα信号传导途径促进HBV-DNA复制。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R735.7;R512.62
【部分图文】：
图 1.1 蛋白质组学研究流程Figure 1.1. The proteomics workflow1.3 尿液样本收集方案在充分告知受试者研究目的与可能的受益，得到受试者同意，并签署知情同意书后，在尿液收集的前一晚，分发 50ml 无酶离心管，嘱咐收集清晨首次中段尿于试管中，尽可能收集至 50ml。收集完后将样本交予研究人员，研究人员将样本置于冰盒，待当日的样本全部收集完毕后，运转至重庆医科大学病毒性肝炎研究所进行下一步的实验。1.4 尿蛋白提取及定量1.4.1 尿蛋白浓缩（1） 首先将收集到的 50ml 尿液于 1000g 转速、4℃条件下离心 10 分钟，
图 1.4 差异蛋白功能富集分析。通过运用 PANTHER 在线数据库，96 个差异蛋白的主要功能通过基因本体论（包括细胞组分、分子功能、生物学过程）和信号通路反映出来。饼图中每个颜色模块大小代表的是指某一条目富集的蛋白数量占比。Figure 1.4 Function enrichment analysis of DEPs. By using the PANTHER online database, theprimary functions of 96 differential proteins are reflected by gene ontology (including cellularcomponents, molecular functions, biological processes) and signaling pathways. The size ofeach color module in the pie chart represents the proportion of protein enriched in an item.2.2.4 蛋白质相互作用网络为进一步了解这些鉴定出的 96 个差异蛋白中哪些蛋白发挥着关键作用，我们创建了蛋白质互作网络，如图 1.5A。在此网络中共有 78 个节点和 199 条连线，其中 18 蛋白未包含在此网络中，是因为其与其他蛋白相互作用关系值小于 0.4。单个蛋白与其他蛋白连线数量越多，说明该蛋白越为关键。正是基于此，我们通过
a 插件将其中连线最多的 15 个蛋白从网络中挑选出来（图1.5B），红色越深，说明连线越多。根据其连线数量，这 15 个蛋白的排序如下：CP，FGA，AFP，CST3，TGOLN2，HSP90B1，VCAN
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本文编号：
2867613
