目的明确云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体感染情况及其影响因素,分析巴尔通体流行株基因型,为有效预防控制云南鼠疫自然疫源地巴尔通体病发生和流行提供基础数据。方法1.样本来源:2015-2016年,在云南玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源地和梁河鼠疫疫源地捕获野外小型兽类共2611只。将捕获的小型兽类带回实验室进行分类鉴定并记录捕获小型兽类的采样地点、季节、种类、性别、海拔、栖息环境等,无菌操作取小型兽类的肝脾,置于2.0 m L冻存管中,编号标记后,-40℃保存。2.样本抽样:采用分层抽样在采集的2549份肝脾样本中,抽取1605份样本作为巴尔通体感染检测对象。3.DNA提取:采用磁珠法微量细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,运用全自动核酸提取仪提取DNA。4.核酸浓度测定:若核酸浓度50ng/μl或A260/A280比值1.8或2.1时,重新提取该样本DNA。5.聚合酶链反应及序列分析:利用聚合酶链反应检测巴尔通体,首先采用荧光定量PCR扩增巴尔通体非编码RNA基因(ssr A),根据标准曲线判定结果,若Cq35为阳性,Cq值≥35为阴性,将阳性样本进一步采用普通PCR扩增ssr A基因片段,将扩增产物送公司测序,将测序所得序列放在NCBI进行同源性比对,利用MEGA7.0构建系统发育树,分析进化关系。6.统计分析:所有数据用Epidata3.0录入,运用R软件,采用率进行统计描述,率的组间比较用χ2,Logistic回归分析野外小型兽类感染巴尔通体的影响因素。结果1.野外小型兽类分布:1605份野外小型兽类肝脾样本分别为玉龙550份,剑川648份,梁河407份。其中齐氏姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠及黄胸鼠样本量占优势,分别为471份、305份、157份、104份。不同地区优势鼠种不同,玉龙鼠疫疫源地和剑川鼠疫源地的优势鼠种为齐氏姬鼠、大绒鼠及中华姬鼠;梁河鼠疫疫源地的优势鼠种为黄胸鼠、斯氏家鼠及锡金小鼠。2.野外小型兽类巴尔通体感染率:在3目6科19属30种1605只野外小型兽类中,25种野外小型兽类感染巴尔通体,野外小型兽类巴尔通体感染率为47.85%(768/1605)。其中短尾鼩属(短尾鼩)感染率为80.00%(20/25)、白腹鼠属(针毛鼠、社鼠、白腹鼠)为59.55%(53/89)、姬鼠属(齐氏姬鼠、中华姬鼠、大耳姬鼠)为55.01%(383/697)、小鼠属(锡金小鼠)为54.55%(24/44)、家鼠属(黄胸鼠、斯氏家鼠、褐家鼠、大足鼠)为51.22%(105/205)、长吻松鼠属(珀氏长吻松鼠)为47.62%(10/21)、鼩鼱属(高山鼩鼱、臭鼩鼱)为45.95%(17/37)、绒鼠属(大绒鼠、玉龙绒鼠、滇绒鼠、黑腹绒鼠)为36.34%(129/355)、麝鼩属(灰麝鼩、长尾大麝鼩)为32.35%(11/34)、毛猬属(毛猬)为32.14%(9/28)、巨鼠属(青毛鼠)为11.11%(1/9)、树鼩属(树鼩)为2.17%(1/46)。2只滇攀鼠和板齿鼠均感染巴尔通体,巢鼠、高山鼩鼱、赤腹松鼠、侧纹岩松鼠、滇绒鼠均未感染巴尔通体。3.地区:玉龙、剑川和梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率分别为50.91%(280/550)、39.97%(259/648)和56.27%(229/407),其中梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率显著高于玉龙和剑川疫源地(c2=29.74,(49)0.05)。4.季节:野外小型兽类春夏秋冬四个季节均有巴尔通体感染,感染率分别为47.63%(171/359)、56.52%(208/368)、44.99%(211/469)、43.52%(178/409),夏季感染率高于秋季和冬季(c2=15.71,(49)0.05)。5.性别:雄性小型兽类巴尔通体的感染率(50.12%)显著高于雌性小型兽类(45.11%)(c2=3.99,(49)0.05)。6.栖息环境:捕获野外小型兽类主要以林地、耕地、林地耕地交界、耕地灌丛交界和灌丛5种栖息环境,其中每种栖息环境野外小型兽类巴尔通体的感染率分别为51.16%(530/1036)、39.66%(92/232)、42.54%(77/181)、48.33%(58/120)、30.56%(11/36),林地感染率最高(c2=17.16,(49)0.05)。7.海拔:随海拔升高,野外小型兽类巴尔通体感染呈升高趋势,但对其中某一海拔梯度具有高度适应性,具体情况为:玉龙鼠疫疫源地2400~2600m感染率为31.15%、2600~2800m为36.84%、2800~3000m为61.54%、3000米以上为48.87%,其中2800~3000m野外小型兽类巴尔通体感染率最高(c2=18.44,(49)0.05);剑川鼠疫疫源地2250~2450m感染率为35.56%、2450~2650m为38.05%、2650~2850m为47.97%,剑川不同海拔梯度野外小型兽类感染巴尔通体无差异(c2=5.31,(49)0.05);梁河鼠疫疫源地1000~1200m感染率为48.72%、1200~1400m为39.50%、1400~1600m为78.18%、1600米以上为63.93%,其中1400~1600m野外小型兽类巴尔通体感染率最高(c2=35.76,(49)0.05)。8.影响因素:云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类感染巴尔通体与采样地区、季节、海拔、鼠种有关。与剑川疫源地相比,玉龙疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.44倍,梁河疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率增加9.16倍;以春季相比,夏季野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.32倍,秋季野外小型兽类感染率降低30%,冬季野外小型兽类感染率降低25%;以齐氏姬鼠相比,中华姬鼠巴尔通体感染率降低5%,大绒鼠巴尔通体感染率降低49%,黄胸鼠巴尔通体感染率降低45%,斯氏家鼠巴尔通体感染率降低59%,其它鼠种巴尔通体感染率降低64%;以1000~1500m海拔带相比,1500~2000m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增加2.21倍,≥3000m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.27倍,2500~3000m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.07倍,2000~2500m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率降低33%。9.巴尔通体遗传进化分析:小型兽类中检测到的巴尔通体基因型包括罗莎利马巴尔通体(Bartonella rochalimae)、日本巴尔通体(Bartonella japonica)、特利波契巴尔通体(Bartonella tribocorum)、森林巴尔通体(Bartonella sylvatica)、马赛巴尔通体(Bartonella rattimassiliensis)和Bartonella washoensis。结论1.云南玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源地及梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率为47.85%,且巴尔通体宿主具有多样性。2.云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类感染巴尔通体受采样地区、季节、海拔、鼠种四个因素影响。梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率最高,剑川鼠疫疫源地最低;春夏秋冬四个季节均有野外小型兽类感染巴尔通体,夏季感染率最高;随海拔升高,野外小型兽类巴尔通体感染率呈上升趋势,但对其中某一海拔具有高度适应性。3.云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体基因型具有多样性,其中3种对人群致病。
【学位单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R516.8
【部分图文】：
第一章 材料与方法第一章 材料与方法料1.1.1 采样点的选取次调查选取云南鼠疫自然疫源地即玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源疫源地远离村落的野外环境为调查区域，根据各疫源地生态地理景观划分不同海拔带作为研究样区，每个海拔带随机选取 2~3 个研究样点
图 2.1 ssrA 片段荧光定量 PCR 结果实时荧光定量 PCR 扩增 ssrA 片段判定为阳性样本为 768 份，送去测序费用昂贵及工作量较大，故将判定为阳性的样本用普通 PCR 扩增 ssrA 片段，电泳结果如图 2.2，挑选目的条带清晰明亮的扩增产物送去测序，共 94 份样本测序成功。PosNeg
基于ssrA基因构建的系统发育树
【参考文献】
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2893175
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