外泌体miRNA作为肺结核生物标志物的研究

发布时间：2021-01-24 09:02

　　目的:本文基于卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Ra株感染人单核巨噬细胞系THP-1,外泌体分离、鉴定,转录组高通量测序,和生物信息学分析,选择差异表达的miRNA,并经初步临床评估,以期望找到潜在的结核病新型标志物。方法:（1）分别用BCG和H37Ra菌株分别对THP-1细胞系进行感染,以未感染作为对照,培养72h后超速离心法提取细胞培养上清的外泌体,western blotting和透射电子显微镜鉴定外泌体。（2）提取外泌体总RNA后,经新一代Illumina高通量测序,RNA-seq数据分析,多种生物信息学方法对测序结果进行差异表达分析,靶基因预测,GO分析和KEGG信号通路分析。（3）选择肺结核患者血清,健康人血清,用试剂盒提取其血清外泌体和miRNA,并用qPCR去验证差异表达的miRNA在临床样本中的表达情况。结果:（1）THP-1细胞在被细菌感染后出现伪足,呈巨噬细胞形态,感染成功;Western blotting表明沉淀同时含有TSG101和CD9这两种外泌体表面蛋白,透射电子显微镜表明沉淀直径在30-150nm范围内且为杯状双层膜结构,结果表明沉淀为外泌体。（2）B... 

【文章来源】：武汉轻工大学湖北省

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要缩略词
1 绪论
    1.1 结核病研究进展
    1.2 结核外泌体研究进展
    1.3 外泌体miRNA研究进展
2 分枝杆菌感染THP-1细胞提取外泌体
    2.1 实验试剂、材料与仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 THP-1细胞系,结核分枝杆菌培养
        2.2.2 诱导THP-1细胞贴壁
        2.2.3 外泌体的提取
        2.2.4 WB鉴定外泌体
        2.2.5 TEM鉴定外泌体
    2.3 实验结果
        2.3.1 THP-1细胞培养和感染
        2.3.2 WB结果
        2.3.3 TEM结果
    2.4 本章讨论
3 外泌体miRNA测序及生物信息学分析
    3.1 实验方法
        3.1.1 外泌体RNA提取及质控
        3.1.2 RNA文库质控
        3.1.3 上机检测
        3.1.4 miRNA生物信息学分析
    3.2 实验结果
        3.2.1 外泌体RNA提取及质控
        3.2.2 RNA文库质量控制结果
        3.2.3 miRNA差异表达分析
        3.2.4 差异表达miRNA靶基因预测
        3.2.5 差异表达miRNA靶基因GO分析
        3.2.6 差异表达miRNA靶基因KEGG pathway分析
    3.3 本章讨论
4 qPCR验证血浆中miR-142-3p
    4.1 实验方法
        4.1.1 样本准备
        4.1.2 囊泡分离
        4.1.3 RNA分离
        4.1.4 反转录
        4.1.5 Real-time PCR
    4.2 实验结果
        4.2.1 ROC曲线分析
        4.2.2 qPCR结果分析
    4.3 本章讨论
5 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
攻读学位期间的研究成果



本文编号：2996974