NIF4蛋白表达和亚细胞定位及其与青蒿素联合疗法抗性相关性研究
发布时间：2021-05-09 23:21
目的:ACTs方案中双氢青蒿素和哌喹联合用药在柬埔寨及邻国被作为一线用药,近几年东南亚地区抗性虫株有明显扩散趋势。过去几年,蛋白激酶和磷酸酶已经成为药物发现的热门靶点,NIF4与被认为是一个潜在的ACT靶点ATG18在恶性疟原虫基因组位置相邻,蛋白磷酸酶NIF4为FCP1类NIFs,能催化RNA20polymerase20II20CTD的去磷酸化。RNA聚合酶II在转录调控中的作用是近年来研究的热点,但在疟原虫方面研究甚少。本研究旨在探索NIF4能否成为ACTs抗性研究新靶点,并初步了解蛋白磷酸酶NIF4蛋白质作用过程,以帮助监视、减缓和阻止抗疟药物耐药性的传播。研究方法:生物信息学分析PF3D7101270020NIF4蛋白结构域、对其重要功能结构域CPDc做系统发育进化树、跨膜区、信号肽以及蛋白3D结构预测;通过构建载体原核表达得到NIF4重组蛋白,免疫日本大耳兔获得免疫血清;ELISA检测NIF4多克隆抗体滴度;3D7进行percoll分期,Western20blot及IFA实验对NIF4进行亚细胞定位及表达分析。恶性疟原虫体外传代培养,进行体外PPQ、DH...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
1 前言
2 材料与方法
2.1 主要试剂和仪器
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.1.3 虫株、实验动物
2.2 主要研究方法
2.2.1 NIF4 生物信息学分析
2.2.2 恶性疟原虫复苏方法
2.2.3 恶性疟原虫体外培养方法
2.2.4 恶性疟原虫冻存方法
2.2.5 提取恶性疟原虫gDNA
2.2.6 构建NIF4 目的片段的重组质粒
2.2.7 重组蛋白原核表达及纯化
2.2.8 阳性克隆小量表达与鉴定
2.2.9 蛋白大量表达及破菌检测
2.2.10 包涵体蛋白纯化
2.2.11 Western blot检测纯化的重组蛋白
2.2.12 重组蛋白多克隆抗体制备
2.2.13 免疫原性检测(ELISA检测免疫效价)
2.2.14 抗体纯化
2.2.15 3D7全虫蛋白提取
2.2.16 Western blot-NIF4 实验方法
2.2.17 间接免疫荧光IFA-NIF4 蛋白定位
2.2.18 3D7 各期蛋白提取
2.2.19 流行区恶性疟原虫野生株的采集
2.2.20 哌喹及双氢青蒿素药物敏感性实验
2.2.20.1 实验原理及实验要求
2.2.20.2 实验步骤
2.2.21 NIF4 片段PCR扩增
2.2.22 NIF4 片段PCR扩增测序
3 结果
3.1 NIF4 生物信息学分析
3.1.1 NIF4 蛋白结构域预测
3.1.2 NIF4 信号肽预测
3.1.3 NIF4 蛋白跨膜区预测
3.1.4 CPDc结构域系统发育进化树分析
3.1.5 CPDc结构域同源比对
3.1.6 NIF4 蛋白的3D结构预测
3.2 恶性疟原虫标准株3D7及DD2 的体外培养
3.3 Western blot检测纯化的重组蛋白
3.4 免疫血清免疫原性检测
3.5 抗体纯化
3.6 NIF4 蛋白定位
3.6.1 Western blot-NIF4 蛋白恶性疟原虫表达检测
3.6.2 IFA-NIF4 蛋白定位
3.7 NIF4 蛋白恶性疟原虫生长不同时期表达
3.7.1 3D7虫株生长分期
3.7.2 各分期虫株IFA-NIF4 蛋白定位
3.7.3 各分期虫株Western blot-NIF4 蛋白定位及表达量比较
3.8 中缅边境恶性疟原虫哌喹及双氢青蒿素体外药物敏感性测定
3.9 NIF4 特异性片段PCR扩增结果
3.10 NIF4 氨基酸突变结果
3.11 NIF4 氨基酸位点与PPQ及 DHA IC50 值的相关性
4 讨论
5 结论
本研究创新性和自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Antimalarial20qinghaosu/artemisinin:20The20therapy20worthy20of20a20Nobel20Prize[J]. Jerapan Krungkrai,Sudaratana Rochanakij Krungkrai. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2016(05)
硕士论文
[1]克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定[D]. 郝明明.昆明医科大学 2013
本文编号：3178211
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
1 前言
2 材料与方法
2.1 主要试剂和仪器
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.1.3 虫株、实验动物
2.2 主要研究方法
2.2.1 NIF4 生物信息学分析
2.2.2 恶性疟原虫复苏方法
2.2.3 恶性疟原虫体外培养方法
2.2.4 恶性疟原虫冻存方法
2.2.5 提取恶性疟原虫gDNA
2.2.6 构建NIF4 目的片段的重组质粒
2.2.7 重组蛋白原核表达及纯化
2.2.8 阳性克隆小量表达与鉴定
2.2.9 蛋白大量表达及破菌检测
2.2.10 包涵体蛋白纯化
2.2.11 Western blot检测纯化的重组蛋白
2.2.12 重组蛋白多克隆抗体制备
2.2.13 免疫原性检测(ELISA检测免疫效价)
2.2.14 抗体纯化
2.2.15 3D7全虫蛋白提取
2.2.16 Western blot-NIF4 实验方法
2.2.17 间接免疫荧光IFA-NIF4 蛋白定位
2.2.18 3D7 各期蛋白提取
2.2.19 流行区恶性疟原虫野生株的采集
2.2.20 哌喹及双氢青蒿素药物敏感性实验
2.2.20.1 实验原理及实验要求
2.2.20.2 实验步骤
2.2.21 NIF4 片段PCR扩增
2.2.22 NIF4 片段PCR扩增测序
3 结果
3.1 NIF4 生物信息学分析
3.1.1 NIF4 蛋白结构域预测
3.1.2 NIF4 信号肽预测
3.1.3 NIF4 蛋白跨膜区预测
3.1.4 CPDc结构域系统发育进化树分析
3.1.5 CPDc结构域同源比对
3.1.6 NIF4 蛋白的3D结构预测
3.2 恶性疟原虫标准株3D7及DD2 的体外培养
3.3 Western blot检测纯化的重组蛋白
3.4 免疫血清免疫原性检测
3.5 抗体纯化
3.6 NIF4 蛋白定位
3.6.1 Western blot-NIF4 蛋白恶性疟原虫表达检测
3.6.2 IFA-NIF4 蛋白定位
3.7 NIF4 蛋白恶性疟原虫生长不同时期表达
3.7.1 3D7虫株生长分期
3.7.2 各分期虫株IFA-NIF4 蛋白定位
3.7.3 各分期虫株Western blot-NIF4 蛋白定位及表达量比较
3.8 中缅边境恶性疟原虫哌喹及双氢青蒿素体外药物敏感性测定
3.9 NIF4 特异性片段PCR扩增结果
3.10 NIF4 氨基酸突变结果
3.11 NIF4 氨基酸位点与PPQ及 DHA IC50 值的相关性
4 讨论
5 结论
本研究创新性和自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Antimalarial20qinghaosu/artemisinin:20The20therapy20worthy20of20a20Nobel20Prize[J]. Jerapan Krungkrai,Sudaratana Rochanakij Krungkrai. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2016(05)
硕士论文
[1]克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定[D]. 郝明明.昆明医科大学 2013
本文编号：3178211
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/chuanranbingxuelunwen/3178211.html
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