吡嗪酰胺耐药相关基因pncA突变及相关蛋白活性检测的研究
发布时间：2017-04-29 11:11
本文关键词：吡嗪酰胺耐药相关基因pncA突变及相关蛋白活性检测的研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的分析pnc A基因不同突变位点对PZase活性的影响。方法收集142株耐多药(Multi-drug resistant,MDR)结核分枝杆菌临床分离株,包括广泛耐药(Extensive drug resistant,XDR)菌株45株、前XDR(pre-XDR)菌株41株,以及普通MDR(细菌对喹诺酮类和氨基糖苷类仍然敏感)菌株56株,应用吡嗪酰胺(Pyrazinamide,PZA)耐药试剂盒测定菌株对吡嗪酰胺的敏感性,并且对所有菌株进行pnc A基因序列测定。挑选pnc A基因存在明显极性改变的基因突变的PZA耐药菌株5株和发生pnc A基因突变的PZA敏感菌株2株,对其pnc A基因进行克隆表达并纯化蛋白,测定其活性。本研究所有实验以结核分枝杆菌试验室标准株H37Rv作为对照,以BCG作为酶活性分析的阴性对照。结果142株临床MDR菌株中,57.7%(82/142)株菌对PZA耐药;其中XDR菌株耐药比例为71.1%(32/45),pre-XDR菌株耐药比例为63.4%(26/41)。XDR和pre-XDR菌株中PZA的耐药率明显高于对喹诺酮类和氨基糖苷类仍然敏感的普通MDR菌株(42.9%,24/56)(c2=8.922,P=0.012);包括pnc A基因启动子区在内,PZA耐药菌中共有85.4%(70/82)的菌株存在pnc A基因突变,而PZA敏感株中pnc A基因突变的率为10%(6/60);以表型药敏试验结果作为金标准,依靠pnc A基因突变诊断吡嗪酰胺耐药的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为85.4%,91.7%,93.3%和82.1%。克隆表达获得的9个蛋白中,野生型pnc A基因表达的蛋白活性为37.2μmol·min-1·mg-1;存在His51Pro和His51Gln突变的蛋白活性接近为0;另外有4株蛋白的(Ala146Thr、His57Asp、Thr76Pro和His71Tyr)蛋白活性与野生型相比降低较为明显;发生78-84位核苷酸GCTGGC缺失的蛋白为不可溶蛋白。MIC检测结果和酶活性分析表明,发生基因突变的PZA“敏感株”实际上为耐药株。结论pnc A基因突变与吡嗪酰胺耐药有很好的相关性,可用于吡嗪酰胺耐药诊断,而表型药敏结果存发生误判的可能;pnc A基因突变导致PZase的蛋白活性降低或者丧失,对酶活性的影响取决于突变的位点和类型。
【关键词】：吡嗪酰胺酶 突变位点 酶活性 耐药
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：
- 缩略词表5-6
- 中文摘要6-8
- Abstract8-10
- 第一章 前言10-16
- 1.1 研究背景10
- 1.2 吡嗪酰胺理化性质10-11
- 1.3 吡嗪酰胺作用机制11-12
- 1.4 吡嗪酰胺主要耐药机制12
- 1.5 吡嗪酰胺酶研究进展12-14
- 1.6 吡嗪酰胺酶活性测定14
- 1.7 吡嗪酰胺表型药敏试验及影响因素14-15
- 1.8 研究目的及研究现状15-16
- 第二章 材料和方法16-30
- 2.1 实验材料16-18
- 2.1.1 菌株来源16
- 2.1.2 实验仪器16-17
- 2.1.3 实验试剂17-18
- 2.2 实验方法18-30
- 2.2.1 吡嗪酰胺表型药敏实验18
- 2.2.2 最小抑菌浓度（MIC）测定18-19
- 2.2.3 pncA基因以及其启动子区测序19
- 2.2.4 载体及酶切位点选取19-20
- 2.2.5 重组蛋白目的基因的选择20-21
- 2.2.6 TA克隆及蓝白斑筛选21-23
- 2.2.7 PET30a-pnc A 的构建23-25
- 2.2.8 PZase 的诱导和表达25
- 2.2.9 PZase的SDS-PAGE分析25-27
- 2.2.10 PZase的纯化27
- 2.2.11 蛋白浓度测定（BCA 法）27-28
- 2.2.12 PZase活性测定28
- 2.2.13 PZase酶的性质分析28-29
- 2.2.14 数据分析29-30
- 第三章 实验结果30-40
- 第四章 讨论40-46
- 4.1 吡嗪酰胺耐药率分析40-41
- 4.2 pncA基因在诊断吡嗪酰胺耐药中的应用价值41-43
- 4.3 pncA基因突变对PZase活性的影响43-46
- 参考文献46-52
- 结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药研究进展52-63
- 参考文献58-63
- 攻读学位期间发表论文情况63-64
- 致谢64-65
- 个人简历65-66
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本文编号：334751
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