大麻素对HPV感染引起的宫颈癌的作用机制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立

发布时间：2017-04-30 14:06

  本文关键词：大麻素对HPV感染引起的宫颈癌的作用机制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的病毒(virus)由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质(Protein)构成或仅由蛋白质构成。一般按遗传物质的不同可将病毒分为DNA病毒、RNA病毒和蛋白质病毒,其中DNA病毒只能感染一种动物(个别例外)。现代医学发现病毒不但具有致病性,一些病毒也具有致癌性。目前的实验研究证明宫颈癌的发生与HPV感染有关,肝癌的发生与HBV感染有关。宫颈癌已成为仅次于乳腺癌的常见妇女恶性肿瘤疾病。根据现有的的数据统计,全球范围内的宫颈癌患者中每年的死亡人数将近20万。每年有高达51万的新发病例而中国每年的新发病例就超过10万。与此同时,中国现有乙肝病毒携带者超过1亿,其中每年因罹患肝癌死亡的人数约有30万。在慢性肝炎患者中,一部分患者肝脏会发生肝纤维化,并进一步发展为肝硬化、肝癌。大麻素是从印度大麻(Cannabis indica)里发现的一组萜酚类化合物,存在于动物神经系统和免疫系统。大麻素发生生物效应的基础是大麻素受体。研究发现,大麻素对乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤等具有抑制作用,在肿瘤组织中,增加大麻素受体在组织中的分泌可以选择性抑制细胞的恶性增殖。另一些研究发现大麻素能够影响HBV慢性感染的患者的肝组织病变进程。本研究旨在构建CB1/CB2基因真核表达载体,选取人肾胚细胞(HEK293)作为生物载体,研究大麻素的生物学特性；选取宫颈癌CaSki细胞系作为研究对象,研究大麻素对对宫颈癌凋亡的影响及相关机制；利用HBVcccDNA建立慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,研究大麻素对肝炎肝组织病变进程的影响及机制。为阐明CB基因的生物活性及其对宫颈癌的影响和机制提供实验依据,同时为进一步研究CB基因对HBV引起的肝损伤可能的作用提供了动物模型。方法1.通过PCR扩增获取目的基因(cannabinoid receptor gene, CB基因)。2.通过双酶切,载体连接,感受态转化,质粒提取等方法获得CB基因真核表达载体,并通过双酶切鉴定重组质粒。3.利用脂质体转染法将CB基因真核表达载体转入HEK293细胞中,通过细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测CB基因的表达及细胞定位。4.利用脂质体转染法将CB基因真核表达载体转入CaSki细胞中通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率。5.通过Western blot和实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax、Bad相关凋亡因子的表达,研究CB基因对宫颈癌的作用机制。.6.通过PCR扩增获得HBV基因,经酶切、纯化后环化等生物方法制备HBVcccDNA。7.利用水动力法尾静脉注射HBVcccDNA至C57BL/6小鼠体内。注射后,分别于第1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w经小鼠尾静脉采集血清样本；于第1w、3w、6w、10w经颈椎脱臼处死后取肝组织。8.利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的浓度变化；荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数；免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和IBcAg的表达；苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化。结果1.PCR产物电泳后分别得到rCB1 (1.5Kb)、CB1 (1.5Kb)、CB2 (1.1Kb)片段。2.双酶切重组质粒后电泳,pCDNA3.1(+)-CBl质粒出现5.3 Kb和1.5 Kb两条带,GV230-CB1质粒出现5.3 Kb和1.5 Kb两条条带,GV230-CB2质粒出现5.3 Kb和1.1Kb两条带。3.重组质粒转染HEK293细胞后,细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦发现CB蛋白表达于HEK293细胞膜和细胞质。4.重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞,流式细胞检测发现CB转染组的细胞凋亡率大于空白组的细胞凋亡率。5.WB和qRT-PCR检测Bcl-2、bad、bax凋亡因子发现CB转染组的bad、bax表达上调,而Bcl-2呈下调。6.PCR获得3.2KbHBV片段,BspQ I酶切、纯化、T4DNA连接酶连接后获得环化的]HBVcccDNA7.放射免疫法检测不同时间点的血清样本,发现HBsAg、HBeAg在小鼠血清中均有表达均呈现四个上升-下降曲线；荧光定量PCR结果显示,随着时间的推移,HBVDNA拷贝数呈下降趋势；免疫组化法检测发现HBsAg、HBcAg在肝组织中表达；HE染色病理分析发小鼠肝脏出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化。结论1.成功构建了CB基因真核表达载体,并证明CB在细胞质和细胞膜上的表达。2.CB能够促进宫颈癌细胞的凋亡。3.CB能够促进宫颈癌细胞凋亡的机制是通过抑制Bcl-2,上调bad、bax。4.成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。
【关键词】：CB基因 HEK293细胞 CaSki细胞 细胞凋亡 乙型肝炎病毒 HBV共价闭合环状DNA 小鼠模型
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33;R512.62;R-332
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照7-10
• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 前言19-25
• 参考文献23-25
• 第一部分 CB1/CB2基因真核表达载体的构建25-39
• 1 材料25-27
• 1.1 实验动物、质粒、细胞及菌株25
• 1.2 主要试剂25-26
• 1.3 主要实验设备26
• 1.4 主要试剂配制26-27
• 1.5 引物设计与合成27
• 2 方法27-32
• 2.1 组织总RNA的提取27-28
• 2.2 逆转录cDNA28
• 2.3 目的基因片段的PCR扩增28-29
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳29
• 2.5 凝胶中DNA的回收29-30
• 2.6 目的基因与载体双酶切30
• 2.7 载体连接30-31
• 2.8 质粒的转化31
• 2.9 阳性克隆菌的筛选和质粒提取31-32
• 2.10 重组质粒的鉴定32
• 2.11 脂质体法转染HEK293细胞32
• 3 结果32-37
• 3.1 目的基因PCR扩增结果32-34
• 3.2 载体鉴定34-36
• 3.3 免疫荧光细胞化学染色联合激光扫描共聚焦显微镜技术检测36-37
• 4 讨论37-38
• 参考文献38-39
• 第二部分：CB1/CB2对宫颈癌CaSki细胞凋亡的影响及作用机制39-50
• 1 材料39-41
• 1.1 主要试剂39
• 1.2 主要实验设备39-40
• 1.3 主要试剂配制40
• 1.4 引物设计与合成40-41
• 2 方法41-42
• 2.1 质粒转染CaSki细胞41
• 2.2 CaSki细胞凋亡的检测41
• 2.3 蛋白表达的Western blot检测41-42
• 2.4 mRNA表达的qRT-PCR检测42
• 2.5 统计学方法42
• 3 结果42-47
• 3.1 流式细胞仪检测细胞凋亡率42-43
• 3.2 Western blot法检测目的蛋白、Bcl-2、Bax、Bad的蛋白表达43-45
• 3.3 荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax、Bad的mRNA表达45-47
• 4 讨论47
• 参考文献47-50
• 第三部分 HBV慢性感染的小鼠模型的建立50-63
• 1 材料与试剂50-51
• 1.1 实验动物50
• 1.2 试剂与仪器50-51
• 2 方法51-52
• 2.1 动物实验51
• 2.2 HBVcccDNA制备51
• 2.3 放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)浓度51-52
• 2.4 荧光定量PCR法检测血清样本和肝组织中HBV DNA拷贝数52
• 2.5 免疫组织化学法检测肝组织中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎c抗原(HBcAg)的表达52
• 2.6 苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化52
• 2.7 统计学方法52
• 3 结果52-58
• 3.1 放射免疫检测结果52-56
• 3.2 荧光定量PCR检测结果56-57
• 3.3 免疫组织化学法检测结果57
• 3.4 苏木素-伊红(HE)染色肝组织病理分析结果57-58
• 4 讨论58-61
• 参考文献61-63
• 全文总结63-64
• 文献综述64-75
• 参考文献69-75
• 致谢75-76
• 攻读硕士期间发表的论文76

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  本文关键词：大麻素对HPV感染引起的宫颈癌的作用机制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：336989