PrxⅠ在LPS诱导小鼠免疫反应过程中的调控作用研究

发布时间：2017-05-03 18:03

  本文关键词：PrxⅠ在LPS诱导小鼠免疫反应过程中的调控作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：过氧化物还原酶I (Peroxiredoxin I, Prx I)是细胞内清除活性氧（Reactive OxygenSpecies, ROS）的过氧化物酶，是过氧化物还原酶家族（Peroxiredoxin fimaly）成员之一。在过去的20年间人们对其进行了广泛的研究，已有较为系统的了解。众多研究结果显示PrxⅠ蛋白除了可以清除活性氧之外，还可以与细胞内诸多蛋白质相互作用，进而在细胞增殖、分化、凋亡、老化、以及癌症的发生、发展方面发挥重要的调控作用。近几年，尤其在肺癌的发生、发展和治疗过程中PrxⅠ的作用受到了广大研究工作者的关注并且取得了系统的了解，但PrxⅠ在免疫反应过程中的调节作用和炎症反应的调控作用还尚不清楚。为了探究PrxⅠ在免疫反应过程中的新功能，本实验利用PrxⅠ基因敲除小鼠和野生型小鼠研究PrxⅠ在LPS诱导的败血性死亡过程中的调控作用。 实验首先利用PrxⅠ基因敲除小鼠和野生型小鼠，检测PrxⅠ基因的缺失在LPS诱导的小鼠死亡上的影响，然后利用组织病理学检测方法（组织HE染色）找出与小鼠死亡相关的主要组织脏器，通过蛋白免疫印迹(Western blot)和酶链免疫反应（ELISA）等分子生物学检测技术，阐明PrxⅠ在LPS诱导的小鼠死亡过程中的保护机制。结果，在LPS腹腔注射后PrxⅠ基因敲出小鼠与野生型小鼠对比死亡率显著增加；组织病理学检测（组织HE染色）发现PrxⅠ基因敲除小鼠与野生型小鼠对比，LPS腹腔注射后肝脏出现大面积细胞死亡现象；ELISA结果显示，，LPS腹腔注射后，PrxⅠ基因敲除小鼠与野生型小鼠对比血清中IL-10的含量明显降低，肝脏组织上清液中TNF-a的含量显著升高；Westernblot检测结果，LPS腹腔注射后PrxⅠ基因敲除小鼠肝脏组织中促进细胞凋亡蛋白Caspase3表达量明显上升，同时与ROS相关的SOD2、Catalase、GPx蛋白质的表达量也随之增加。 以上结果表明，当机体受到LPS攻击时，PrxⅠ基因的缺失会显著增加小鼠的死亡率，并且由于PrxⅠ基因缺失引起的高死亡率直接与肝脏组织的大面积凋亡和肝脏中蓄积的ROS水平有关。因此，我们认为PrxⅠ作为抗氧化物酶通过抑制肝脏内活性氧水平的升高而起到保护机体免受氧化应激引起的损伤，可作为一种败血性死亡治疗剂靶向蛋白。
【关键词】：脂多糖 过氧化物还原酶Ⅰ 活性氧 炎症反应 基因敲除小鼠
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R515.3
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 文献综述11-21
• 1.1 引言11-12
• 1.2 败血症定义12
• 1.3 败血症致病机理及研究模型的制作12-14
• 1.4 内毒素14-15
• 1.5 Toll 样受体15-17
• 1.5.1 TLRs 的细胞定位16
• 1.5.2 TLRs 信号通路16-17
• 1.6 过氧化物还原酶（peroxiredoxins）家族17-19
• 1.6.1 PrxⅠ对细胞的保护作用与其他蛋白的相互作用18-19
• 1.6.2 PrxI 与炎症反应19
• 1.7 研究的意义19-21
• 第二章 实验材料及方法21-29
• 2.0 材料与方法21
• 2.1 实验材料21
• 2.1.1 PrxⅠ基因敲除小鼠21
• 2.1.2 小鼠腹腔巨噬细胞获得21
• 2.2 主要实验用试剂21-24
• 2.3 主要实验仪器24
• 2.4 小鼠基因型鉴定（Genotyping）24-25
• 2.4.1 DNA 提取24-25
• 2.4.2 PCR 反应25
• 2.4.3 琼脂糖凝胶电泳25
• 2.5 小鼠组织的 HE 染色25-26
• 2.5.1 试验样品获得25
• 2.5.2 HE 染色25-26
• 2.6 ELISA（试剂盒）方法检测细胞因子26-27
• 2.6.1 样品获取26
• 2.6.2 ELISA 试剂盒（夹心 ELISA）检测26-27
• 2.7 格里斯试剂检测 NO 浓度27
• 2.7.1 Griess 试剂的配制27
• 2.7.2 标准曲线制备27
• 2.8 流式细胞仪检测脾脏中 T cell27-28
• 2.8.1 脾脏细胞获取27
• 2.8.2 脾脏细胞荧光染色27-28
• 2.9 免疫印迹（Western blotting）检测蛋白表达变化28-29
• 2.9.1 组织蛋白样品收集28
• 2.9.2 组织蛋白浓度测量28-29
• 第三章 实验结果29-39
• 3.1 小鼠基因型的鉴定29
• 3.2 LPS 腹腔注射后，PrxⅠ基因敲除小鼠与野生型小鼠对比死亡率升高29-30
• 3.3 小鼠腹腔炎性细胞 ROS 水平和细胞数量变化30-32
• 3.4 流式细胞术分析脾脏淋巴细胞32-33
• 3.5 外周血细胞因子分析33-34
• 3.6 LPS 诱导小鼠死亡组织病理分析34-35
• 3.7 LPS 处理后肝脏细胞间细胞因子变化35-36
• 3.8 LPS 处理后肝脏细胞内凋亡信号分析36-37
• 3.9 LPS 处理后肝脏细胞内 ROS 相关蛋白分析37-39
• 第四章 讨论39-43
• 第五章 结论43-45
• 参考文献45-49
• 附录49-53
• 致谢53-55
• 个人简历55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 付永锋,樊廷俊;Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡[J];生物化学与生物物理学报;2002年04期

2 王筱冰;张小翠;夏妙红;刘全宏;;Caspase的活化机制[J];现代生物医学进展;2006年03期

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本文编号：343461