乙肝大鼠模型建立及相关肝纤维化研究

发布时间：2017-05-10 02:15

  本文关键词：乙肝大鼠模型建立及相关肝纤维化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球范围影响人类健康的重要问题,目前全球慢性乙肝感染者约有4亿人。HBV慢性化进程往往伴随着肝纤维化的发生,肝纤维化是慢性肝炎向肝硬化、肝癌发展的必经阶段。如若活动性肝纤维化得不到有效控制,最终约10%-30%可发展为肝硬化,甚至肝癌。我国属于HBV高流行区,乙肝肝纤维化是我国常见肝纤维化原因之一。目前认为其机制归因于肝细胞的损伤与免疫细胞及细胞因子在肝组织局部浸润。持续HBV体内复制可加速肝纤维的病理损伤,导致细胞外基质(ECM)在肝内过度沉积。HBV具有非常严格的宿主特异性,自然状态下仅感染人类及灵长类动物,由于缺乏合适的HBV实验动物模型,对慢性乙肝感染及该过程中发生的肝细胞损伤机制仍缺乏深入了解。HBV转基因小鼠模型是目前最常用的动物模型,这种转基因小鼠的HBV基因整合在宿主染色体中,其自身处于免疫耐受状态,可实现持续HBV体内的复制,但因其不形成HBV前基因组RNA复制的原始模板cccDNA,同时免疫耐受也不利于观察到小鼠肝损伤后修复反应及肝纤维化形成。而目前实验用肝纤维化动物模型多采用施以不同剂量肝毒剂化学诱导法建模,如四氯化碳、二甲基亚硝胺、乙醇等,还包括免疫诱导法、胆管阻塞法及复合方法等,这些肝纤维化动物模型具有造模简单,成模率高,死亡率低,重复性佳等特点,但与我国极常见的乙肝肝纤维化发病机制相差甚远。如何建立与人HBV自然状态感染过程类似的HBV动物模型,是研究其发病机制及治疗应用的基础,也是研究如何阻断乙肝肝纤维化进程的关键。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)是临床治疗基因病常用病毒载体之一,根据AAV8亚型的高嗜肝性特点,本研究应用携带1.3拷贝HBV基因组的重组8型腺相关病毒载体(rAAV8-1.3HBV)经腹腔注射法导入SD大鼠体内,拟建立一种新型的模拟人类HBV感染及相关肝纤维化进程的实验动物模型,旨在为国内乙肝肝纤维化研究提供新视角。方法：采用rAAV8-1.3HBV经腹腔注射新生SD大鼠,固定时间点(2周、4周、8周、12周)检测大鼠血清及肝脏中乙肝抗原(HBsAg. HBeAg)表达及HBV DNA拷贝数,第12周处死并采集大鼠肝脏,制作病理切片行HE和Masson染色评价肝组织炎症活动度分级和肝纤维化分期,免疫组化检测乙肝核心抗原(HBcAg)阳性肝细胞的表达情况,以及转化生长因子β1(TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(a-SMA)等肝纤维相关因子的表达。结果：实验组大鼠(0日龄,6雄7雌)腹腔注射1×1011vg的rAAV8-1.3HBV,对照组注射等体积PBS溶液。2周后采用ELISA法检测血清中HBsAg、HBeAg,实验组雄性3820±828IU/mL,雌性3369±1581IU/mL, HBeAg分别为133±46 NCU/mL和7771 NCU/mL,乙肝抗原均为强阳性,感染率100%;4周、8周时血清HBsAg、 HBeAg仍为阳性,但HBeAg下降趋势较明显：12周时实验组HBsAg显示呈弱阳性.HBeAg基本为阴性(n=11,84.6%),对照组乙肝抗原检测全阴。荧光定量PCR法检测大鼠血清及肝脏HBV DNA拷贝数,2周时血清HBV DNA波动于2.95×106至8.27×104copy/nmL,个体间存在差异,总体雄性略高于雌性,随时间变化拷贝数缓慢下降,但12周时仍维持较高拷贝数；第12周检测肝脏HBV DNA拷贝数明显高于同期血清含量(p0.001)。第12周处死大鼠取肝脏做病理切片。HE染色见实验组普遍出现肝细胞肿胀、点灶状坏死及嗜酸性变,汇管区扩大及淋巴细胞浸润炎性改变。Masson染色见汇管区周围纤维化,有不同程度纤维间隔形成,无假小叶形成。肝脏免疫组化证实肝内存在HBcAg阳性细胞,这直接证明了rAAV8-1.3HBV注射建模法可感染大鼠肝细胞并持续进行HBV肝内复制。免疫组化同时观察到TGF-β1细胞因子的阳性表达,提示该模型已启动乙肝肝纤维化进程。结论：经检索国内外尚无此类大鼠模型的报道。本项目首次利用rAAV8-1.3HBV体内转导法建立HBV大鼠模型,并在观察期12周内监测到乙肝抗原表达和HBV体内复制,并观察到HBV大鼠模型肝组织炎性改变及肝纤维化进程。该动物模型的应用价值及创新点在于造模简单,能较好模拟人类HBV感染过程及肝纤维化形成。
【关键词】：乙型肝炎病毒 肝纤维化 腺相关病毒 大鼠模型
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62;R-332
【目录】：

• 中英文缩略表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 rAAV8-1.3HBV载体的制备与滴度检测14-22
• 1 材料与方法15-17
• 2 结果17-20
• 3 讨论20-22
• 第二部分 乙肝肝纤维化大鼠模型的建立22-42
• 1 材料与方法22-26
• 2 结果26-39
• 3 讨论39-42
• 参考文献42-46
• 综述46-54
• 参考文献50-54
• 攻读硕士期间发表文章54-55
• 致谢55

【参考文献】

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1 董小岩;尉迟捷;王刚;田文洪;陆月;张风卫;王文;王岳;谭文杰;吴小兵;;高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转导法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型[J];病毒学报;2010年06期

2 李瑗;苏建家;杨春;曹骥;欧超;梁亮;杨芳;王琦;;乙型肝炎病毒树，

本文编号：353822