实时PCR在结核分枝杆菌异烟肼耐药突变分子诊断中的应用研究

发布时间：2022-01-02 16:27

　　结核病是全球范围内危害最为严重的慢性传染病之一,在众多结核治疗药物中,异烟肼作为一线药物广泛使用,导致耐异烟肼结核发生率高,危害面广。本论文着重建立异烟肼耐药突变检测体系,并评价其应用,为最终建立起适合临床应用的异烟肼耐药突变检测、指导其正确使用提供合适手段。论文内容包括：耐药结核病的流行和诊治现状评述（第一章）、实时PCR探针熔解曲线法检测异烟肼耐药突变体系的建立和分析性能评价（第二章）、上述体系的多中心临床评价（第三章）、应用上述技术进行的异烟肼耐药突变流行病学调查（第四章）以及针对最常见katG S315T突变所建立的一种稀有突变定量体系（第五章）,分述如下：第一章绪论首先概述了结核病的流行现状、临床诊断和治疗方案,描述了结核菌的生物学背景,针对性地阐述了异烟肼的作用原理和结核异烟肼耐药机制,总结了结核耐药检测尤其是耐异烟肼检测的现状及最新进展,并介绍了本实验室新近建立的探针熔解曲线分析（PMA）技术检测突变的原理,最后提出了本论文的目的、内容及意义。第二章异烟肼耐药突变PMA检测体系的建立和性能评价已有研究证实的异烟肼耐药突变相关区域包括katG315密码子、inhA启动子区、... 

【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：138 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    第一节 结核病概况
        1.1 结核病流行现状
        1.2 结核菌的分类、形态与结构
        1.3 结核病的常规临床诊断和治疗
    第二节 异烟肼耐药概述
        2.1 异烟肼药物作用机制
        2.2 异烟肼耐药机制
    第三节 结核耐药突变检测现状
        3.1 结核耐药传统和分子检测平台
        3.2 结核耐药突变分子检测试剂盒
        3.3 结核异烟肼耐药突变分子检测的意义
    第四节 熔解曲线分析技术
        4.1 PMA适用机型
        4.2 PMA在结核耐药突变检测上的应用
        4.3 改良分子信标
        4.4 PMA动力学
    第五节 本论文的研究目的、内容和意义
    参考文献
第二章 异烟肼耐药突变PMA检测体系的建立和性能评价
    第一节 引言
    第二节 材料和方法
        2.1 实时PCR扩增的引物及探针的设计
        2.2 菌株和质粒来源
        2.3 核酸提取
        2.4 PCR仪器
        2.5 PCR扩增和熔解程序
        2.6 结果统计
        2.7 测序分析
    第三节 结果与分析
        3.1 人工靶序列熔解曲线
        3.2 标本DNA提取方法比较
        3.3 PMA体系的分析灵敏度评价
        3.4 PMA体系的特异性评价
        3.5 PMA体系的NTM特异性评价
        3.6 PMA体系不均一耐药突变检测能力评价
        3.7 PMA体系重复性评价
        3.8 PMA体系适用机型评价
    第四节 讨论
    参考文献
第三章 PMA体系的多中心验证
    第一节 引言
    第二节 材料和方法
        2.1 参考菌株
        2.2 结核临床菌株
        2.3 核酸提取
        2.4 PCR仪器
        2.5 PCR扩增和熔解程序
        2.6 统计分析
        2.7 测序分析
    第三节 结果与分析
        3.1 PMA体系检测通量
        3.2 PMA体系判定标准
        3.3 PMA体系检测结果与药敏比较
        3.4 PMA体系检测结果与测序结果比较
        3.5 临床异烟肼不均一耐药突变株
    第四节 讨论
    参考文献
第四章 厦门和漳州两地异烟肼耐药的流行病学分析
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 结核分枝杆菌标准株H37Rv
        2.2 菌株来源
        2.3 核酸提取
        2.4 主要试剂、仪器与PCR扩增和熔解程序
        2.5 判读标准
        2.6 测序分析
    第三节 结果
        3.1 临床标本检测流程
        3.2 临床标本检测
    第四节 讨论
    参考文献
第五章 实时PAP定量检测结核异烟肼耐药突变
    第一节 引言
    第二节 材料和方法
        2.1 质粒和痰标本的来源及提取方法
        2.2 引物设计和合成制备
        2.3 实时PAP反应体系、扩增程序和仪器
        2.4 DNA测序分析
        2.5 统计分析
    第三节 结果与分析
        3.1 PAP引物制备验证
        3.2 实时PAP体系分析灵敏度评价
        3.3 实时PAP体系分析特异性评价
        3.4 实时PAP体系分析选择性评价
        3.5 实时PAP检测阈值定义
        3.6 临床标本检测
    第四节 讨论
    参考文献
附表 46株分枝杆菌中文名和拉丁文名索引
英文缩写索引
博士期间发表交流论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Xpert结核分枝杆菌/利福平试验对结核病及耐多药结核病诊断价值的Meta分析[J]. 尹青琴,焦伟伟,孙琳,肖婧,吴喜蓉,刘芳,苗青,徐放,韩锐,田建岭,申阿东.  中国循证儿科杂志. 2012(05)
[2]新型结核病疫苗的研究现状与发展趋势[J]. 吴雪琼.  中国防痨杂志. 2012(03)
[3]出生队列研究在中国结核病分布中的应用[J]. 康万里,端木宏谨,郑素华.  中国防痨杂志. 2011(09)
[4]应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药基因[J]. 姚春艳,张立群,府伟灵.  中华医院感染学杂志. 2010(11)
[5]耐多药结核病快速诊断试剂盒检测耐药结核分枝杆菌的评价[J]. 桂晓虹,徐鹏,赵明,王莉莉,武洁,李静,高谦,梅建.  中华结核和呼吸杂志. 2010 (01)
[6]华东地区耐药结核分枝杆菌katG基因的变异[J]. 金嘉琳,张文宏,翁心华,胡忠义,陈澍,邵凌云.  中华传染病杂志. 2006(05)
[7]耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因突变研究[J]. 陈曦,马玙,金奇,姜广路,李传友,王庆.  中华结核和呼吸杂志. 2005(04)
[8]16S～23SrDNA内转录间隔区序列分析及其在分支杆菌鉴定中的应用价值[J]. 李国利,庄玉辉,赵铭,王国治,范以虎,陈保文,胡忠义.  中华结核和呼吸杂志. 2002(03)

硕士论文
[1]置换探针实时PCR检测微生物耐药突变[D]. 温慧欣.厦门大学 2006



本文编号：3564504