HEV ORF2单克隆抗体的筛选及用于病毒检测的研究
发布时间：2022-02-22 15:15
戊型肝炎是由戊肝病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的一种传染性疾病,目前发病率已超过甲肝,是我国急性肝炎的主要类型。HEV基因组全长序列含有3个开放蛋白编码框（ORF13）,其中ORF2基因编码HEV的主要结构蛋白。ORF2蛋白免疫原性强且包含中和表位集中区域。目前已有基于HEV ORF2蛋白研发的HEV抗原检测试剂盒应用于临床诊断及治疗监测中,但对于农村地区和城镇社区基层医疗单位,需要更快速、便捷的HEV抗原检测方法。本研究前期制备出多株抗HEV ORF2单克隆抗体,通过间接ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）实验对单抗进行型别分析,比较单抗间亲和力差异,筛选出与抗原结合能力强、具有广谱性的单克隆抗体;利用免疫印迹法（Western blot,WB）和竞争抑制ELISA实验对单克隆抗体识别ORF2抗原的空间位点及空间位置特征进行分析,在此基础上利用HEV疫苗免疫后兔血清和自然感染者血清分析抗体优势表位,为HEV诊断、疫苗及感染机制的研究提供了理论基础。将上述优势抗体进行组合,采用双抗体夹心法研制HE...
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HEV感染机体后HEV标志物的动态变化[13]
河北大学医学硕士学位论文8构生物学的方法来进行精确定位的。8C11通过用晶体培养及X射线衍射的方法，成功获得了8C11单抗Fab段和基因IV型HEVE2s蛋白（HEVORF2段，455-602aa）的晶体结构，进而研究出8C11位于Asp496~Thr499、Val510~Leu514和Asn573~Arg5783个非连续区，表明Glu479、Ser97、Arg512、His577、Arg57和Lys534是8C11的结合位点，参与抗原抗体相互作用最为关键的氨基酸是Arg512[49,50]。8G12单抗也通过与8C11单抗相同的分析方法，识别出8G12识别识别HEV构象型表位主要基于E549、K554和G591三个结合位点上[51]，具体如图1-2[50,51]所示：（a）图中E2s、8C11Fab重链和8C11Fab轻链分别用绿色、紫色和黄色表示；重链、轻链分别用VH和CH、VL和CL表示；（b）图中E2S侧面，8C11重链和轻链与E2S相互作用表位残基分别以紫色和黄色表示，Arg512在与两条链相互作用时被标记为红色；（c）图中E2s（I）、8G12Fab重链和8G12Fab轻链分别用紫色、深绿和浅绿表示；（d）图中E2s侧面静电表面电位（红色为负；蓝色为正；灰色为中性）和8G12与E2S相互作用表位残基；（e）图中8C11与8G12在E2S上的结合区域，分别用灰色和黄色表示。图1-28C11与8G12两株单抗Fab段与E2S抗原蛋白复合体结构图；（a）8C11单抗与E2S抗原复合物；（b）8C11单抗在E2S抗原结合表位；（c）8G12单抗与E2S抗原复合物；（d）8G12单抗在E2S抗原结合表位；（e）8C11与8G12单抗在E2S抗原结合表位1.2.3戊型肝炎实验室诊断技术现状及分析戊型肝炎的实验室诊断手段多基于HEV抗原、HEVRNA和HEV血清抗体（主要包括lgG、lgM和lgA）检测，可以根据不同的实验目的选择诊断方法。由于HEVlgM抗体较早出现于lgG抗体，HEV感染主要依靠血清中lgM抗体的
第一章绪论11图1-3本课题实验流程图1.5创新点目前由我国北京万泰生物药业公司获得批准生产的人体血液HEVAg检测试剂盒（ELISA）是目前全球唯一商业化HEVAg临床诊断试剂盒，因灵敏度高、特异性良好在全球的戊型肝炎科学研究及临床诊断中广泛应用。近期有研究者在HEV患者尿液中发现了HEV抗原，并证明抗原排出体外的持续时间长于核酸，考虑到尿液样本收集更加方便，本课题希望筛选出亲和力高的HEVORF2单克隆抗体，制备成免疫荧光快检试剂，可以快速、便捷的检测尿液样品中HEVAg，为今后的科学研究及医疗工作提供基矗1.筛选出HEVORF2高亲和力、广谱的单克隆抗体，对抗体进行型别、抗原表位结构分析，以及对单克隆抗体是否是HEVAg通过免疫原性刺激机体产生的血清中起主要结合作用的优势抗体进行分析，可以更加全面的了解单克隆抗体的性质，为后续实验提供更好的数据支持。2.研发一种检测HEVAg的免疫荧光快检试剂，该试剂的检测样品为尿液，相比于血液样品，尿样采集更为方便；并且免疫荧光快检试剂操作简单方便、耗时短，可以满足在医疗条件差或科研水平较低的地区完成HEV检测等相关工作。
【参考文献】：
期刊论文
[1]单克隆抗体表位分析技术的研究进展[J]. 赵晓瑞,毛晓燕. 中国生物制品学杂志. 2018(05)
[2]戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其中和表位的结构研究进展[J]. 郑明华,王凯航,李琼,张晓,李少伟,夏宁邵. 中国人兽共患病学报. 2016(09)
[3]戊型肝炎病毒感染实验室诊断方法研究进展[J]. 纪文芳,温桂平,唐自闽,夏宁邵,郑子峥. 病毒学报. 2016(03)
[4]氢氘交换质谱联用法在蛋白质结构研究中的应用[J]. 陈金波,赵大伟. 佳木斯教育学院学报. 2011(08)
[5]抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究[J]. 熊君辉,郭清顺,葛胜祥,顾颖,陈毅歆,苗季,杜海莲,史维国,张军,夏宁邵. 病毒学报. 2008(02)
[6]戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体的鉴定[J]. 顾颖,葛胜祥,黄果勇,李少伟,朱子恒,何志强,陈毅歆,王颖彬,张军,夏宁邵. 病毒学报. 2003(03)
博士论文
[1]戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析及其ORF2蛋白在昆虫细胞中表达的研究[D]. 齐影.吉林大学 2015
本文编号：3639706
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HEV感染机体后HEV标志物的动态变化[13]
河北大学医学硕士学位论文8构生物学的方法来进行精确定位的。8C11通过用晶体培养及X射线衍射的方法，成功获得了8C11单抗Fab段和基因IV型HEVE2s蛋白（HEVORF2段，455-602aa）的晶体结构，进而研究出8C11位于Asp496~Thr499、Val510~Leu514和Asn573~Arg5783个非连续区，表明Glu479、Ser97、Arg512、His577、Arg57和Lys534是8C11的结合位点，参与抗原抗体相互作用最为关键的氨基酸是Arg512[49,50]。8G12单抗也通过与8C11单抗相同的分析方法，识别出8G12识别识别HEV构象型表位主要基于E549、K554和G591三个结合位点上[51]，具体如图1-2[50,51]所示：（a）图中E2s、8C11Fab重链和8C11Fab轻链分别用绿色、紫色和黄色表示；重链、轻链分别用VH和CH、VL和CL表示；（b）图中E2S侧面，8C11重链和轻链与E2S相互作用表位残基分别以紫色和黄色表示，Arg512在与两条链相互作用时被标记为红色；（c）图中E2s（I）、8G12Fab重链和8G12Fab轻链分别用紫色、深绿和浅绿表示；（d）图中E2s侧面静电表面电位（红色为负；蓝色为正；灰色为中性）和8G12与E2S相互作用表位残基；（e）图中8C11与8G12在E2S上的结合区域，分别用灰色和黄色表示。图1-28C11与8G12两株单抗Fab段与E2S抗原蛋白复合体结构图；（a）8C11单抗与E2S抗原复合物；（b）8C11单抗在E2S抗原结合表位；（c）8G12单抗与E2S抗原复合物；（d）8G12单抗在E2S抗原结合表位；（e）8C11与8G12单抗在E2S抗原结合表位1.2.3戊型肝炎实验室诊断技术现状及分析戊型肝炎的实验室诊断手段多基于HEV抗原、HEVRNA和HEV血清抗体（主要包括lgG、lgM和lgA）检测，可以根据不同的实验目的选择诊断方法。由于HEVlgM抗体较早出现于lgG抗体，HEV感染主要依靠血清中lgM抗体的
第一章绪论11图1-3本课题实验流程图1.5创新点目前由我国北京万泰生物药业公司获得批准生产的人体血液HEVAg检测试剂盒（ELISA）是目前全球唯一商业化HEVAg临床诊断试剂盒，因灵敏度高、特异性良好在全球的戊型肝炎科学研究及临床诊断中广泛应用。近期有研究者在HEV患者尿液中发现了HEV抗原，并证明抗原排出体外的持续时间长于核酸，考虑到尿液样本收集更加方便，本课题希望筛选出亲和力高的HEVORF2单克隆抗体，制备成免疫荧光快检试剂，可以快速、便捷的检测尿液样品中HEVAg，为今后的科学研究及医疗工作提供基矗1.筛选出HEVORF2高亲和力、广谱的单克隆抗体，对抗体进行型别、抗原表位结构分析，以及对单克隆抗体是否是HEVAg通过免疫原性刺激机体产生的血清中起主要结合作用的优势抗体进行分析，可以更加全面的了解单克隆抗体的性质，为后续实验提供更好的数据支持。2.研发一种检测HEVAg的免疫荧光快检试剂，该试剂的检测样品为尿液，相比于血液样品，尿样采集更为方便；并且免疫荧光快检试剂操作简单方便、耗时短，可以满足在医疗条件差或科研水平较低的地区完成HEV检测等相关工作。
【参考文献】：
期刊论文
[1]单克隆抗体表位分析技术的研究进展[J]. 赵晓瑞,毛晓燕. 中国生物制品学杂志. 2018(05)
[2]戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其中和表位的结构研究进展[J]. 郑明华,王凯航,李琼,张晓,李少伟,夏宁邵. 中国人兽共患病学报. 2016(09)
[3]戊型肝炎病毒感染实验室诊断方法研究进展[J]. 纪文芳,温桂平,唐自闽,夏宁邵,郑子峥. 病毒学报. 2016(03)
[4]氢氘交换质谱联用法在蛋白质结构研究中的应用[J]. 陈金波,赵大伟. 佳木斯教育学院学报. 2011(08)
[5]抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究[J]. 熊君辉,郭清顺,葛胜祥,顾颖,陈毅歆,苗季,杜海莲,史维国,张军,夏宁邵. 病毒学报. 2008(02)
[6]戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体的鉴定[J]. 顾颖,葛胜祥,黄果勇,李少伟,朱子恒,何志强,陈毅歆,王颖彬,张军,夏宁邵. 病毒学报. 2003(03)
博士论文
[1]戊型肝炎病毒（HEV）组成和结构的分析及其ORF2蛋白在昆虫细胞中表达的研究[D]. 齐影.吉林大学 2015
本文编号：3639706
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