一种新的同时定量检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA的检测方法

发布时间：2022-05-03 00:04

　　目的设计并建立一种新的能够同时测定核酸提取物中乙型肝炎病毒（HBV）前基因组RNA（pgRNA）和DNA的检测方法。方法建立检测HBV pgRNA和DNA的探针法双重荧光定量PCR体系,通过DNA凝胶电泳、定量PCR等实验考察该检测体系的特异性和灵敏度,验证以该方法测定HepG2.2.15细胞及其培养上清中HBV pgRNA和DNA的可行性及准确度。结果建立的探针法双重荧光定量PCR体系具有较好的特异性和灵敏度,测定不同稀释倍数的细胞培养上清时,在稀释倍数和测定结果间具有较好的相关性。但该方法更适用于测定细胞培养上清中的HBV pgRNA和DNA,而不适用于测定细胞样本。结论本实验建立的方法能够避免核酸提取物中由于HBV DNA污染造成HBV RNA定量不准的问题,并且在一管PCR反应中同时实现了HBV pgRNA和DNA的双重检测,极大提高了检测效率,具有潜在的临床应用价值。 

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【部分图文】：

PCR产物的DNA凝胶电泳图

为保证本检测方法的通用性,从HBV database网站上下载了8条不同的HBV全基因组序列(HBV基因型A、B、C、D各2条),对比其共有保守序列设计引物和探针。本方法检测的是包括rcDNA和cccDNA在内的总HBV DNA,rcDNA相较于cccDNA在正链有部分缺失,因此避开rcDNA正链缺失部分,选择rcDNA和cccDNA共有的双链部分设计上、下游引物和探针,分别命名为AF、AR、PA,PCR产物seq A长度为173 bp,定位于HBV基因组的S区;HBV RNA包括0.7、2.1、2.4、3.5 kb 4种不同长度的5种RNA(图 1)[10-11]。为了特异性检测pgRNA,避免其他RNA的干扰,在pgRNA 5"端1 kb内的区间设计上、下游引物和探针(这段区间内的序列只有3.5 kb全长的转录本才有,其他较短的RNA转录本缺失此段序列,因此可以实现pgRNA的特异性检测),分别命名为BF、BR、PB,PCR产物seq B长度为118 bp,定位于HBV基因组的C区。引物、探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物探针组A的上游引物AF(方向5"-3",下同)序列为GTG GTG GAC TTC TCT CAA TTT TCT AG,下游引物AR序列为TGA GGC ATA GCA GCA GGA TG,探针PA和修饰基团序列为FAM-ACG CCG CAG ACA CAT-MGB;引物探针组B的上游引物BF序列为CCC TAT CTT ATC AAC ACT TCC GGA,下游引物BR序列为AGA TCT TCT GCG ACG CGG,探针PB和修饰基团序列为Texas Red-CGT CTG CGA GGC GAG-MGB。1.2 细胞系及其培养方法

【参考文献】：
期刊论文
[1]慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）[J]. 王贵强,王福生,庄辉,李太生,郑素军,赵鸿,段钟平,侯金林,贾继东,徐小元,崔富强,魏来.  中华实验和临床感染病杂志(电子版). 2019(06)
[2]慢性乙型肝炎抗病毒治疗相关新型标志物及其临床应用[J]. 鲁凤民,曾婉嘉,文夏杰,廖昊,邹军,王雷婕,席婧媛,王建文,王杰,陈香梅.  肝脏. 2019(05)
[3]慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA检测的临床意义[J]. 鲁凤民,窦晓光,张文宏,王福生.  临床肝胆病杂志. 2018(05)



本文编号：3650227