2009-2010年云南省肠道病毒相关无菌性脑炎的分子流行学研究

发布时间：2017-06-06 07:00

  本文关键词：2009-2010年云南省肠道病毒相关无菌性脑炎的分子流行学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：无菌性脑炎是由多种病毒引起的以脑膜刺激征等中枢神经系统感染症状为主的临床疾病。据报道85%以上的脑炎病例是由肠道病毒引起。该病可以发生在任何年龄段的人群,但易感人群通常为15岁以下的儿童。其传播途径为粪-口和呼吸道途径。近年来随着研究的深入,肠道病毒引起的无菌性脑炎的报道逐年增多,呈世界性分布,在中国大陆的不同省市或地区也常有报道,已经成为严重影响少年儿童卫生健康的公共卫生问题。云南省位于中国西南边陲,气候宜人,为肠道病毒的传播流行提供了有利条件。本研究采集了云南省某儿童医院524例无菌性脑炎患儿的临床样本,进行病原学、统计学、遗传学分析,旨在为云南省在该领域的研究提供重要的病原学和遗传学资料,完善引起无菌性脑炎的肠道病毒病原谱的构成。首先,对肠道病毒的PCR引物进行筛选。从国内外文献报道中常用的引物中选出3组5对引物,以(Coxsackievirus A16, CVA16)、(Coxsackievirus B5, CVB5)和(Echovirus 20, E20)为实验对象,结果最优引物组合为：适用于扩增B群肠道病毒的为B-OS/B-OAS和B-IS/B-IAS,适用于扩增肠道病毒A群为EntAF/EntARo和EntAF／Ent AFi。其次,对采集的524份临床样本按照标准进行处理,然后采用分子生物学和BLAST比对等方法对其病原学分析及临床资料的统计学分析。结果,肠道病毒占18.4%(97例),其中主要的血清型有E30(16.5%)、CVB5(23.5%)、E9(24.7%),另外还检出CVA16、CVA9、CVB2、CVB3、CVB4、E4、E6、E15、E16、E18、E21、E33和E12等血清型。统计结果显示,临床症状、实验室检查结果与感染肠道病毒之间无对应关系。最后,对部分检出肠道病毒的临床样本进行病毒分离、全基因组测序及其遗传特性的分析。经鉴定A155/YN/CHN/2009为CVB4, A108/YN/CHN/2009和 A242/YN/CHN/2009为CVA9。A155/YN/CHN/2009与原型株J. V. B Benschoten在VP1和全基因组的核苷酸序列同源性分别为85.1%、83.3%。系统进化分析显示A155/YN/CHN/2009与其他中国大陆流行株属于同一基因型(genotype)。重组分析结果表明A155/YN/CHN/2009是一株重组病毒。A108/YN/CHN/2009和A242/YN/CHN/2009与原型株Griggs在VP1和全基因组的核苷酸序列同源性为分别为81.3%,81.0%和80.7%,81.1%。对CVA9的全长VP1基因进行系统进化分析,本实验分离株与其他中国株属于同一基因型。重组分析结果显示,A108/YN/CHN/2009 和 A242/YN/CHN/2009也发生了重组。2009-2010年引起云南省无菌性脑炎的肠道病毒主要血清型为E30、CVB5和E9；CVB4分离株A155/YN/CHN/2009,CVA9分离株A108/YN/CHN/2009和A242/YN/CHN/2009发生重组。另外,筛选出最佳的肠道病毒引物。这为无菌性脑炎的预防和控制提供实验室基础,同时也为今后的相关的研究提供背景资料及方法。
【关键词】：无菌性脑炎 肠道病毒 引物 血清型 同源性 重组分析
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-20
• 1. 无菌性脑炎概述10-11
• 2. 肠道病毒概述11-19
• 2.1 肠道病毒的结构特征11-13
• 2.2 肠道病毒分类13-14
• 2.3 肠道病毒的致病性14-18
• 2.4 肠道病毒的检测方法18-19
• 3. 立题分析19-20
• 3.1 立题目的19
• 3.2 立题意义19-20
• 第一章 引物的筛选：基于定型肠道病毒的VP1基因的不同巢式或半巢式PCR评价20-28
• 引言20
• 1 材料与方法20-23
• 1.1 病毒株和临床样品20-21
• 1.1.1 病毒株20
• 1.1.2 临床样品20-21
• 1.2 引物设计和合成21
• 1.3 病毒株感染性滴度检测21-22
• 1.4 病毒RNA的提取22-23
• 1.4.1 粪便样本处理22
• 1.4.2 提取病毒RNA22-23
• 1.5 巢式或半巢式PCR23
• 2 结果23-26
• 2.1 病毒株感染性滴度23-24
• 2.2 不同稀释度病毒株巢式或半巢式PCR24-25
• 2.3 临床样品巢式或半巢式PCR25-26
• 3 讨论26-27
• 4 小结27-28
• 第二章 病原学和临床资料分析28-43
• 引言28
• 1 材料和方法28-30
• 1.1 研究对象28
• 1.2 临床流行病学资料28
• 1.3 临床样本28-29
• 1.4 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肠道病毒29
• 1.4.1 试剂29
• 1.4.2 主要仪器与耗材29
• 1.5 临床样本RNA的提取29-30
• 1.5.1 样本处理29
• 1.5.2 引物29-30
• 1.5.3 测序确定基因型30
• 1.6 进化树的构建30
• 2 结果与分析30-40
• 2.1 肠道病毒血清型分析30-31
• 2.2 E9、CVB5和E30的系统进化分析31-36
• 2.3 E9、CVB5和E30核苷酸和氨基酸同源性分析36-37
• 2.4 临床资料的统计学分析37-40
• 2.4.1 人口学特征37-38
• 2.4.2 临床症状和实验室检查结果统计学分析38-40
• 3 讨论40-42
• 4 小结42-43
• 第三章 CV-B4和CV-A9的全基因组分析43-62
• 引言43
• 1 材料和方法43-48
• 1.1 细胞株、试剂、耗材、仪器设备43-44
• 1.1.1 细胞株43
• 1.1.2 试剂43-44
• 1.1.3 耗材44
• 1.1.4 仪器设备44
• 1.2 病毒分离44-45
• 1.2.1 样本处理44
• 1.2.2 细胞培养44
• 1.2.3 标本接种44
• 1.2.4 结果观察44-45
• 1.3 病毒RNA的提取、VP1 RT-PCR、测序和定型45-47
• 1.3.1 病毒RNA的提取45-46
• 1.3.2 RT-PCR46
• 1.3.3 测序46
• 1.3.4 引物46-47
• 1.3.5 定型47
• 1.4 系统进化分析和重组分析47
• 1.5 进化分析中用到的核酸序列的GenBank登录号(accession numbers)47-48
• 2 结果48-60
• (一) CV-B448-55
• 2.1 CV-B4基因型的确定48-49
• 2.2 A155分离株的全基因组分析49-50
• 2.3 系统进化分析50-52
• 2.4 重组分析52-55
• (二) CV-A955-60
• 2.5 A108和A245在KMB17细胞株上出现病变55
• 2.6 A242和A108的全基因组分析55-56
• 2.7 系统进化分析56-58
• 2.8 重组分析58-60
• 3 讨论60-61
• 4 小结61-62
• 结论62-63
• 展望63-65
• 参考文献65-68
• 缩略词表68-69
• 致谢69-70
• 个人简历70-71

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