基于高通量测序的病原体筛查与确认

发布时间：2017-06-26 08:04

  本文关键词：基于高通量测序的病原体筛查与确认，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新发突发传染病是全世界面临的一个重要威胁,诸如气候变暖、人口增长、抗生素滥用、经济全球化、世界都市化、自然生态环境改变、人和野生动物接触频繁、跨国旅行人口数量激增及速度加快等因素,都极大增加了新发传染病发生和传播的可能性。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的统计,自1973年以来,人类已发现至少48种新的病原体,例如人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)、重症急性呼吸综合征病毒(Severe acute respiratory syndrome,SARS)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、禽流感病毒和猪流感病毒等。新型传染病正以平均每年新增一种的速度发生,并跨越国境在全球范围传播。因此对新发、突发传染病病原体进行快速筛查和确认,在最短的时间内获得病原体信息,是有效控制疫情和应对突发生物危害事件的基础。传统的病原体鉴定技术在病原体感染检测方面已日趋乏力。随着聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术的出现,临床上基于核酸检测的病原体鉴定技术已经显著提高了检测成功率。最常见的基于PCR技术的检测方法需要病原体的基因组序列信息。然而,并不是在所有情况下病原体基因组序列信息都是已知的。针对先前并无相关报道,也未曾在人类中发现过的新型病原体,缺少相关的基因组序列信息,这限制了对该病原体导致疫情的检测。在实际情况中,在疾病诊断时,未知病原体感染占据很高的比例。近年来,越来越多对人类健康有重大意义的新型病原体,通过高通量测序技术得以发现,而传统的生物技术手段却未曾发现它们的存在,这提示高通量测序技术在病原微生物发现方面是一种新颖、有效的手段。高通量测序技术的发展使得对复杂微生物标本的研究成为可能,为洞察包括海洋、土壤以及人体等在内的不同来源样本的微生物群落多样性提供全新的视野。这些研究方法包括两种手段,一种是基于16S rDNA基因测序方法以确定系统发育关系;更多的是另一种方法,基于大规模Shotgun测序方法,研究样本中物种组成以及基因多态性。16S rDNA分子中,不仅含有高度和中度保守的序列区域,又含有高度变化的序列区域,而且其片段长度约1 540 bp,既便于分析,又含有足够多的信息,因此16S rDNA基因测序可用于复杂标本中细菌亲缘关系的研究。而全基因组测序,则可针对遗传进化特征、个体基因差异、致病机理、耐药机制及其传播规律进行研究。新一代高通量技术所需要的测序时间大大缩短,同时成本也越来越低,跨越了传统生物学研究方法所不能逾越的鸿沟,为比较基因组学、流行病学和微生物演化研究掀开崭新一页。近些年,人兽共患病发病人数一直居于传染病人数的前列,sars、狂犬病、禽流感等人兽共患病,对人类健康和公共卫生安全造成巨大的威胁。由猴疱疹病毒(simianvaricellavirus,svv)引起的猴水痘(simianvaricella,sv)疾病,在临床上与人类水痘带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,vzv)感染有相似的症状,已有研究证实svv和vzv之间具有抗原相关性,因此对svv进行深入研究是十分必要的。2014年某动物中心饲养的非洲绿猴发生未知疫情,导致多只绿猴死亡。本研究采用高通量测序探究该疫情的致死因素。本实验取死亡绿猴的肝、肺组织样品,提取病毒总dna,基于病毒宏基因组学技术,使用iontorrentpgm平台进行高通量测序,并借助生物信息学方法分析测序数据中的病毒组,寻找绿猴死亡可能的致死因素;根据高通量测序筛查结果设计引物,对样本进行qpcr定量检测,进一步确认组织样品中病毒的存在。对死亡绿猴的组织样品测序共产生原始测序数据共674mb,读序(reads)数达到4.76m条,通过序列拼接,获得了该病毒长约124kb的全基因组序列。序列比对发现,测序数据中有大量的序列与猴水痘带状疱疹病毒具有高度的同源性,与目前已知的猴疱疹病毒9型的同源性达到98%以上。根据测序结果设计猴疱疹病毒特异性引物,采用qpcr对标本和病毒纯培养物进行定量检测,肝脏、肺脏和病毒培养物的ct值分别为23、20和16,可见两组织中均存在大量病毒,肺组织中的猴疱疹病毒滴度较肝组织高。本研究采用高通量测序作为传染病疫情的快速筛查技术,确认此次绿猴死亡的致死病原体为猴水痘带状疱疹病毒。新发传染病中,除由病毒引发的传染病,还有一类为细菌引起的感染。由于细菌与病毒结构不同,因而标本采取的处理方式也不同。某实验动物中心在一次动物实验中,发现一例食蟹猴非正常死亡,死亡原因未知,本研究采用高通量测序技术对未知致死病原体进行检测。本实验直接对病变脑组织样品进行细菌核酸提取和16srdna的v1-v2区扩增,通过宏基因组学测序及生物信息学分析,在不依赖培养手段的情况下,短时间内获取病变脑组织的菌群构成。然后,对脑组织匀浆物进行分离培养,分离得到的2株细菌经16srdna一代测序进行种属鉴定,随后完成shotgun测序和mate-pair大片段库测序。在获得全基因组后,利用rast进行基因组注释,分析基因组上可能存在的毒力基因和耐药基因,最后通过动物实验验证2株细菌的毒力。宏基因组测序结合组织病理学的检查结果,提示导致食蟹猴死亡可能是由于致病细菌的感染作用。分离培养得到的2株细菌经一代测序鉴定为巨型球菌和巴黎链球菌,进行基因组shotgun测序,巴黎链球菌测序数据经过拼接获得27个contigs,与参考序列streptococcuslutetiensis033(genbank:cp003025.1)同源性达98%;巨型球菌测序数据拼接后得到28个contigs,与参考序列macrococcuscaseolyticus(genbank:ap009484.1)比对,发现其同源性仅为74%,认为分离培养的巨型球菌为一个新种。对巨型球菌基因组进行Mate-Pair测序,获得基因组全序,全长为2 391 704 bp,借助RAST注释,得到其基因组中含有2 430个CDS,73个RNA,并发现了其中疑似的ClpP、ClpX、ResD等9个毒力基因,以及抗四环素、氨基糖苷类、氟喹诺酮、利福平等6个耐药基因。最后通过细菌的BALB/c小鼠颅内注射,与大肠工程菌对照组相比,巨型球菌和巴黎链球菌均存在较高致病性,可致小鼠死亡。上述研究结果显示,巨型球菌和巴黎链球菌的混合感染可能与食蟹猴的死亡相关,但具体的疾病发生过程以及致死机制的阐明仍需要后续的深入研究。
【关键词】：病原体筛查与确认 宏基因组测序 全基因组测序 基因组学
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R51;R440
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-19
• 1. 研究背景13
• 2. 高通量测序概述及应用13-16
• 2.1 罕见病的基因组测序13-14
• 2.2 癌症基因组测序14-15
• 2.3 高通量测序在新病原体发现方面的应用15-16
• 3. 目前高通量测序技术的局限性16
• 4. 高通量测序技术的未来16-17
• 5. 立题依据17
• 6. 本文研究内容17-19
• 第一章 未知病毒感染的高通量筛查与确认19-33
• 1. 材料与方法20-24
• 1.1 实验材料20
• 1.2 组织切片的制备和观察20-21
• 1.3 样本制备21
• 1.4 病毒总核酸提取21
• 1.5 DNA测序文库构建及测序21-23
• 1.6 生物信息学分析23
• 1.7 病毒的细胞培养23
• 1.8 病毒纯培养物基因组的提取23-24
• 1.9 实时定量PCR检测24
• 2. 实验结果24-32
• 2.1 病毒基因组质控结果24
• 2.2 Bioanalyzer 2100鉴定结果24-25
• 2.3 测序结果概述25
• 2.4 病毒基因组拼接和分析25-29
• 2.5 实时定量PCR检测结果29-31
• 2.6 病理组织检查31-32
• 3. 讨论32
• 4. 结论32-33
• 第二章 未知细菌感染的高通量测序筛查与确认33-58
• 1. 材料和方法33-41
• 1.1 实验材料33-34
• 1.2 组织切片的制备和观察34-35
• 1.3 样本前期制备35
• 1.4 微生物的核酸提取35-37
• 1.5 RNA测序文库构建及测序37-38
• 1.6 16S rDNA V1-V2区扩增38
• 1.7 组织的宏基因组测序38-39
• 1.8 细菌纯培养及鉴定39
• 1.9 细菌的全基因组测序39-41
• 1.10 动物实验41
• 2. 实验结果41-56
• 2.1 病理学检查41-42
• 2.2 微生物核酸质检42
• 2.3 RNA-seq42-44
• 2.4 16S rDNA的V1-V2高变区扩增44
• 2.5 宏基因组测序44-47
• 2.6 细菌纯培养及鉴定47-49
• 2.7 全基因组测序49-55
• 2.8 动物实验55-56
• 3. 讨论56-57
• 4. 结论57-58
• 全文总结58-59
• 参考文献59-65
• 个人简介65-66
• 致谢66

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本文编号：485363