梅毒螺旋体金属蛋白酶的表达及对纤维蛋白原水解活性研究

发布时间：2017-07-02 11:10

  本文关键词：梅毒螺旋体金属蛋白酶的表达及对纤维蛋白原水解活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质(ECM)纤维蛋白原(Fg)的水解能力及其机制,为深入研究Tp的致病机制提供实验依据。方法:(1)Tp0751野生型和突变型蛋白原核表达、纯化:从Genbank上查获Tp0751的基因序列(不含信号肽氨基酸编码序列),构建野生型p ET30a(+)/Tp0751、p ET30a(+)/Tp0751 H198A突变型和p ET30a(+)/Tp0751 H202A突变型蛋白原核表达重组载体,重组质粒在经双酶切、PCR和测序鉴定后被转化到BL21表达菌中进行重组蛋白的诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定经Ni-NTA纯化的目的蛋白的表达形式,BCA法测定蛋白的浓度;Western blot鉴定经Ni-NTA纯化的目的蛋白。(2)野生型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。(3)H198A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将H198A突变型Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测H198A突变型Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。(4)H202A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将H202A突变型Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测H202A突变型Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。结果:(1)Tp0751蛋白原核表达、纯化:酶切及测序结果表明重组野生型p ET30a(+)/Tp0751质粒的插入片段序列与Gen Bank上面公布的序列完全一致,经两点法构建的突变型重组质粒构建成功;该插入片段能够表达26KDa大小的可溶性重组蛋白,该重组蛋白经纯化后的纯度达到90%;该重组蛋白的Western blot结果表明,其与梅毒阳性病人的免疫血清产生特异性的免疫反应。(2)Tp0751蛋白对Fg水解能力检测:Tp0751蛋白具有水解Fg的能力,在反应持续24小时后Fg基本上被水解完全。(3)H198A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:H198A突变型Tp0751蛋白具有一定的水解Fg能力,在反应持续24小时后Fg部分被水解。(4)H202A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:H202A突变型Tp0751未表现出明显的水解Fg的能力,在反应持续24小时后Fg基本未被水解。结论:(1)Tp0751重组蛋白具有水解Fg的能力;(2)Tp0751蛋白HEXXH域的突变能抑制Tp0751蛋白降解Fg的能力;H198EXXH202结构域中影响Tp0751蛋白降解Fg的位点可能是202位的H而不是198位的H。
【关键词】：梅毒螺旋体 金属蛋白酶 Tp0751 水解活性 致病机制
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R759.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 主要中英文缩写10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 实验材料13-17
• 2.1 菌株和质粒13
• 2.2 血清标本及来源13
• 2.3 仪器设备13-14
• 2.4 主要试剂14-17
• 第3章 实验方法17-30
• 第一部分 Tp0751 重组质粒的构建及 Tp0751 重组蛋白的鉴定17-25
• 3.1 Tp0751 基因的扩增17-18
• 3.2 原核表达载体的构建及鉴定18-23
• 3.3 Tp0751 重组蛋白的制备23-25
• 第二部分 梅毒螺旋体金属蛋白酶对纤维蛋白原水解活性研究25-30
• 3.4 野生型 Tp0751（wt-Tp0751）水解纤维蛋白原的活性25-27
• 3.5 H198A 突变型 Tp0751 蛋白体外水解人 Fg 的活性研究27-28
• 3.6 H202A 突变型 Tp0751 蛋白体外水解人 Fg 的活性研究28-30
• 第4章 实验结果30-36
• 4.1 Tp0751 重组质粒的构建及 Tp0751 重组蛋白的鉴定30-32
• 4.2 梅毒螺旋体金属蛋白酶对纤维蛋白原水解活性研究32-36
• 第5章 讨论36-40
• 第6章 结论40-42
• 参考文献42-45
• 文献综述45-53
• 参考文献50-53
• 科研成果53-54
• 致谢54

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