乙型肝炎表面抗原主蛋白与烯酰辅酶A水合酶相互作用对细胞脂代谢影响的研究

发布时间：2017-07-03 07:17

  本文关键词：乙型肝炎表面抗原主蛋白与烯酰辅酶A水合酶相互作用对细胞脂代谢影响的研究

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【摘要】：目的:通过在人肝癌细胞株Hep G2中瞬时转染乙型肝炎表面抗原主蛋白(small hepatitis b surface antigen,SHBs),观察SHBs与烯酰辅酶A水合酶(enoyl Coa hydratase,ECHS1)相互作用对细胞生长和细胞内脂质代谢的影响,初步探导SHBs与ECHS1相互作用在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis b,CHB)患者发生肝脂肪变中的可能作用。为未来CHB合并脂肪肝分子机制的进一步研究提供实验依据和理论基础。方法:1.以pc DNA3.1(+)质粒为载体构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SHBs和pc DNA3.1(+)-ECHS1。2.建立SHBs瞬时转染细胞模型:将pc DNA3.1(+)-SHBs通过脂质体转入Hep G2细胞中,同时设立未转染Hep G2细胞和转染空载质粒pc DNA3.1(+)作为对照,24h后通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase reaction,RT-PCR)法验证转染组细胞内SHBs的表达。3.设计并合成针对ECHS1的si RNA序列插入到p Silencer载体中,通过脂质体将插入ECHS1-si RNA阴性对照序列的p Silencer、pc DNA3.1(+)-ECHS1、插入了有效ECHS1干扰序列的p Silencer分别转入已成功表达SHBs基因的Hep G2细胞中,同时设立未转染Hep G2细胞、转染空载质粒Hep G2细胞和单纯转染SHBs的Hep G2细胞作为对照。4.转染后48h用半定量RT-PCR和Western Blot分别从m RNA水平和蛋白质水平检测ECHS1及脂代谢相关基因的表达情况,并测定各转染组细胞培养液中的转氨酶水平和细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)及甘油三酯(triglyceride,TG)的含量,油红O染色观察细胞内脂滴蓄积情况。结果:1.成功建立Hep G2细胞SHBs的瞬时转染模型2.与未转染Hep G2细胞相比,单纯SHBs转染组及SHBs+ECHS1-si RNA阴性序列对照组在核酸水平ECHS1、LPL、Apo A1表达分别下降,ACC表达升高,PPARα和CPT1A表达无明显变化,蛋白水平的上述基因的表达趋势同核酸基本一致,细胞培养液中转氨酶升高,细胞内胆固醇含量升高,甘油三酯含量下降。3.相比单纯SHBs转染组:在转染了SHBs的Hep G2细胞中过表达ECHS1可在核酸和蛋白水平上调LPL的表达(P0.05),下调Apo A1、ACC和CPT1A的表达(P0.05),而对PPARα的表达无影响(P0.05);且细胞培养液中转氨酶水平、细胞内TC及TG含量均下降。4.相比单纯SHBs转染组:在转染了SHBs的Hep G2细胞中靶向下调ECHS1可在核酸水平下调LPL和Apo A1,上调ACC、CPT1A表达,但Apo A1表达要高于ECHS1过表达组,而PPARα表达无明显变化,蛋白水平的上述基因的表达趋势同核酸基本一致,但CPT1A表达未升高,另外细胞培养液中转氨酶水平、细胞内胆固醇及甘油三酯均升高。5.在所有转染组Hep G2细胞中油红O染色未观察到明显的脂滴蓄积。结论:SHBs可能损伤肝细胞,并通过干扰脂肪酸代谢中某些基因的表达影响细胞脂质代谢,但这种效应可能不是完全通过PPARα通路产生的,且在整个实验期内未造成明显的细胞内脂质沉积,具体机制有待进一步研究。
【关键词】：乙肝表面抗原主蛋白 烯酰辅酶A水合酶 HepG2 脂质代谢
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 英汉缩略词对照表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-31
• 结果31-50
• 讨论50-57
• 小结57-58
• 参考文献58-67
• 综述67-81
• 参考文献75-81
• 致谢81

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