体内细胞因子捕获实验（IVCCA）测定日本血吸虫感染后细胞因子动态变化及与肝纤维化关系的研究

发布时间：2017-07-05 00:04

  本文关键词：体内细胞因子捕获实验（IVCCA）测定日本血吸虫感染后细胞因子动态变化及与肝纤维化关系的研究

  更多相关文章： 日本血吸虫 IVCCA 肝纤维化 实时荧光定量PCR 虫卵肉芽

【摘要】：血吸虫病是一种慢性蠕虫性疾病,全球约有2亿多患者。它主要是以肝、肠虫卵肉芽肿和随之伴随的纤维化为主要特征的免疫病理性疾病。一般认为CD4+T细胞亚群在抗血吸虫感染及免疫调控过程中起着重要作用,其中辅助性细胞Th1、Th2是主要的效应性CD4+T细胞亚群;调节性T细胞(regulatory T,Treg)在血吸虫感染免疫病理机制中总体上起免疫下调作用;新近发现的Th17细胞也积极参与抗血吸虫免疫反应。随着血吸虫感染的进程发展,以上四种CD4+T细胞亚群在数量及功能呈现不同的变化趋势,对感染发生、发展及纤维化病理进程等起重要的调控作用。同时,这些CD4+T细胞亚群之间也存在复杂的相互调节(cross-talk)。宿主感染血吸虫后,机体的免疫应答主要由Th1、Th2、Treg、Th17细胞及其分泌的细胞因子相互调控。在感染急性期,即感染后三周内,宿主要针对移行中的幼虫及成虫的免疫应答。其主导型应答为Th1细胞免疫,此种免疫应答主要是由虫体抗原及虫体移行时机械创伤所致的急性免疫应答。当成虫开始产卵时,Th2免疫应答逐渐增强,并形成以肝脏肉芽肿为主要特征的病理性改变。同时CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞也逐渐增殖活化,产生免疫抑制效应,防止T细胞过度活化,使血吸虫导致的炎性反应逐渐减弱。随着Th17细胞的发现,越来越的研究揭示Th17细胞及其分泌的IL-17在血吸虫感染过程中具有重要的调控作用。无论是采用基因敲除还是抗体中和等手段来抑制Th17细胞活化及其分泌的细胞因子,均能明显减小虫卵肉芽肿体积和宿主炎症反应。因此,若能准确地了解血吸虫感染过程中上述免疫细胞分泌细胞因子的动态变化,将对调控血吸虫感染而导致的肝纤维化病变具有重要意义。而目前检测宿主感染血吸虫后细胞因子变化的方法主要是通过体外刺激脾脏细胞、淋巴细胞等来检测细胞因子在蛋白质、mRNA水平的变化,以此间接地反映感染过程中宿主体内各种细胞因子的动态变化。不过,上述方法只是反映某个器官的细胞体外细胞因子分泌水平,不能完整反映宿主体内细胞因子的实际水平和变化。鉴于上述检测方法的局限性,有人就提出体内细胞因子捕获实验(invivocytokinecaptureassay,ivcca),该方法不仅可以从宿主整体水平上检测感染后各种细胞因子的动态变化,而且其检测灵敏性较高,可弥补上述检测方法的不足。这对以后更深层次地探索细胞因子在血吸虫感染过程中的作用和对感染过程中分泌量较少的细胞因子的检测具有重要的意义。因此,本论文拟采用ivcca检测日本血吸虫感染后体内细胞因子的动态变化,并初步探讨细胞因子与肝纤维化的关系。本研究内容主要分为以下两个部分:第一部分ivcca的建立以及与体外检测结果的比较目的:建立ivcca方法学,检测c57bl/6小鼠感染日本血吸虫后,ifn-?、il-4、il-10及il-17的动态变化,并与体外检测结果比较。方法:建立小鼠感染日本血吸虫模型:c57bl/6小鼠25只,雌性,6周龄,贴腹感染日本血吸虫尾蚴15条/只。分别于感染后0、3、5、7、10和12周,随机选取5只感染和3只未感染小鼠,分别用ivcca和elisa法检测血清中ifn-?、il-4、il-10及il-17分泌量。人道处死小鼠并收集成虫确保感染的一致性;无菌制备脾脏细胞悬液,分别用含anti-cd3/cd28和pma/ionomycin体外培养48小时,elisa检测上述细胞因子分泌水平;pma/ionomycin和golgistop体外培养6小时,收集细胞做细胞内因子染色检测,用于体外对照。结果:ivcca检测方案具有可行性,ivcca血清检测结果:小鼠血清中ifn-?分泌量于感染后持续增加,感染后?周(感染后不同时间点的检测结果与对照组进行两两比较,下同)达到高峰(p0.05),之后逐渐下降并维持在较高的水平;il-4和il-17分泌量也于感染后持续增加,感染后?周达到高峰(p0.05),之后逐渐下降并维持在较高的水平;il-10的分泌量于感染后持续增加。而常规elisa检测法却未能在感染早期的鼠血清中检测到上述细胞因子。体外脾脏细胞培养上清elisa和细胞内细胞因子染色检测结果:anti-cd3/anti-cd28和pma/ionomycin刺激结果均表明,ifn-?、il-4、il-10及il-17分泌量均于感染后持续上升。细胞内细胞因子染色结果也提示treg、th1、th2及th17细胞在脾脏总细胞中的比例均于感染后持续上升。结论:我们成功建立了体内细胞因子捕获实验(ivcca)检测日本血吸虫感染后细胞因子的动态变化并与体外细胞培养检测结果作了比较。ivcca具有敏感性高、能从宿主整体水平上动态检测感染后细胞因子的变化,且无须处死小鼠。本法为t细胞及相关细胞因子在体内免疫病理机制中的作用的研究提供了一个有用的工具;不仅可用于血吸虫,也可用于其它寄生虫、微生物感染的相关研究。第二部分日本血吸虫感染后细胞因子的动态变化与肝纤维化关系的研究目的:探讨c57bl/6小鼠感染日本血吸虫后细胞因子的动态变化及与肝纤维化的关系。方法:建立小鼠感染日本血吸虫模型,c57bl/6小鼠25只,雌性,6周龄,贴腹感染日本血吸虫尾蚴15条/只。分别于感染后0、3、5、7、10和12周随机选取5只小鼠,人道处死小鼠并收集成虫。取肝脏(按其生理分页),分别做石蜡病理切片he和masson三色染色、虫卵计数、羟脯氨酸含量、实时定量pcr测定,如tgf-β、i型胶原蛋白(coli)及iii型胶原蛋白(coliii)。无菌制备脾脏细胞悬液,采用虫卵可溶性抗原(solubleeggantigen,sea)体外培养72小时后,收集上清elisa检测ifn-?、il-4、il-10及il-17分泌水平。结果:在感染后5周,发现肝脏中有虫卵沉积,并且随感染时间的延长,肝脏中虫卵负荷逐渐增加。虫卵肉芽肿于感染后7周面积最大(p0.05),之后逐渐缩小。masson三色染色结果显示,感染后5周虫卵周围出现少量蓝色的纤维条索,并随感染时间的延长,蓝色纤维条索逐渐增多,其变化趋势与羟脯氨酸检测结果的趋势一致。tgf-β、coli及coliiimrna检测结果显示,tgf-?、coliii基因表达水平于感染后持续增加,在感染后7周达到高峰(p0.05),之后又逐渐下降,coli基因表达水平也于感染后持续增加,感染后10周达到高峰(p0.05),之后又逐渐下降。sea刺激脾脏细胞结果表明,ifn-?分泌量在感染后各个时间点均对sea呈低反应性(p0.05);il-4分泌量在感染后5周内对sea反应不明显,但在感染后7周分泌量显著上升(p0.05),之后又逐渐下降;il-17分泌量于感染后5周开始上升,并于感染后7周时达到顶峰(p0.05),之后又逐渐下降;il-10分泌量于感染后持续增加。结论:c57bl/6小鼠感染血吸虫后,随着虫卵在肝脏组织中的沉积,逐渐形成以虫卵为中心的肉芽肿炎症反应。在感染后7周,炎症反应比其他检测时间点更为剧烈,虫卵肉芽肿面积最大。随后炎症反应开始逐渐减弱,虫卵肉芽肿面积逐渐变小,虫卵周围浸润的炎性细胞减少,取而代之的是大量胶原细胞。这与ivcca检测结果中的il-4、il-10及il-17的变化趋势一致。体外sea培养结果提示il-4、il-10及il-17均参与了肝脏虫卵肉芽肿炎症反应及纤维化形成等免疫病理反应,sea可能直接活化th2,th17和Treg等T细胞亚群。而SEA不能显著诱导Th1代表性细胞因子IFN-?的产生。以上结果提示感染后肝脏炎症肉芽肿反应在一定程度上反映了体内抗炎性细胞因子(如TGF-?1和IL-10)和促炎性细胞因子(IL-17)相互作用的动态变化结果。感染7周后,体内炎症促进因素逐渐减弱,抑制因素逐渐增强。从而使虫卵肉芽肿面积减小,炎症反应减弱,转向免疫调整(immunomodulation)状态。
【关键词】：日本血吸虫 IVCCA 肝纤维化 实时荧光定量PCR 虫卵肉芽
【学位授予单位】：江苏省血吸虫病防治研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R532.21
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 IVCCA的建立以及与体外检测结果的比较17-34
• 1 材料与试剂17-20
• 2 方法20-26
• 3 结果26-32
• 4 讨论32-34
• 第二部分 日本血吸虫感染后细胞因子动的态变化与肝纤维化关系的研究34-52
• 1 材料与试剂34-36
• 2 方法36-43
• 3 结果43-50
• 4 讨论50-52
• 全文小结52-53
• 参考文献53-56
• 硕士在读期间发表论文及参与课题56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李石柱;郑浩;高婧;张利娟;朱蓉;许静;郭家钢;肖宁;周晓农;;2012年全国血吸虫病疫情通报[J];中国血吸虫病防治杂志;2013年06期

，

本文编号：519778