日本血吸虫虫卵及相关抗原的研究

发布时间：2017-07-05 20:22

  本文关键词：日本血吸虫虫卵及相关抗原的研究

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【摘要】：血吸虫病是人畜共患寄生虫病。血吸虫感染的实验诊断在血吸虫病防治中发挥重要作用,目前血吸虫虫卵依然是主要的血吸虫病诊断抗原,对血吸虫虫卵的提取、虫卵可溶性抗原(SEA)的认识依然不足。本课题目的是建立一种快速提取纯净虫卵的方法;检测用该法提取虫卵制备SEA作为血吸虫病检测抗原的可行性;然后采用免疫亲和层析的方法收集与血吸虫病IgG发生特异性结合的SEA组分并进行鉴定和分析;最后从鉴定的抗原组分中选取一种抗原进行基因的克隆表达,检测其作为诊断抗原的价值。用不同浓度的NaOH、在不同温度、用不同时间消化含有虫卵的肝脏匀浆液,以确定虫卵提取最佳条件;用方阵实验确定以此法提取的SEA最佳抗原包被浓度并采用ELISA法检测现场获得的75份血吸虫阳性、60份血吸虫阴性水牛血清,以评价抗原的检测效果;最终用该SEA组分试制了日本血吸虫血清检测的间接血凝试剂。结果表明NaOH消蚀法提取组织中虫卵的最佳条件为:NaOH浓度为5%~10%,反应温度为45℃,反应时间为5-10min;该法制备的虫卵纯净度高,得率为常规法的3倍以上;NaOH消蚀法提取抗原的检测灵敏度比过筛提取虫卵所得抗原显著性提高(p0.05);用消蚀法提取虫卵抗原检测水牛血清其灵敏性为93%,过筛法为88%,特异性为100%,过筛法为97%(P0.05)。所试制的间接血凝试剂对于检测兔、鼠血清具有较好的效果。为进一步从SEA获得具有诊断价值的主要抗原信息,从血吸虫病阳性鼠血清纯化得到IgG,并将其固化到树脂上;通过免疫亲和层析的方法收集与IgG发生特异性结合的SEA抗原组分并进行质谱鉴定、糖蛋白和生物信息学分析。结果显示:阳性BALB/c鼠血清中纯化的IgG通过免疫亲和层析收集SEA的组分保持了抗原性;质谱共鉴定到76个蛋白群的262个蛋白质;主要参与血吸虫的代谢过程、生物调节、应激反应等;这些蛋白具有结合及催化活性、电子载体活性、酶调节活性等相关功能;Dot-blot/SDS-PAGE结合糖蛋白染色显示,SEA层析组分具有糖链成分且为各种糖蛋白的组合,分子量分布范围从37-170kd;N-端糖基化预测显示抗原组分中有57个蛋白群中的蛋白具有N-端糖基化位点;这些可能的糖蛋白主要参与信号传导、免疫系统过程、应激反应、移动等生物过程。根据虫卵可溶性抗原鉴定信息,选取SjP40蛋白作为研究对象;利用PCR获得了基因的全长表达片段,构建了该基因的原核表达质粒pET-28a(+)-SjP40并获得了重组表达蛋白,rSj P40主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blot显示rSj P40有较好的免疫原性;收集感染血吸虫不同阶段的的BALB/c鼠血清检测显示rSjP40具有早期诊断效果。
【关键词】：日本血吸虫 虫卵 抗原成分 SjP40
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R532.21
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-14
• 第一章 引言14-23
• 1.1 血吸虫病概述14
• 1.2 血吸虫病实验诊断方法研究概况14-18
• 1.2.1 检测虫卵方法14-15
• 1.2.2 检测抗体方法15-17
• 1.2.3 检测抗原方法17
• 1.2.4 检测DNA方法17-18
• 1.3 血吸虫病诊断用抗原研究概况18-22
• 1.3.1 虫体抗原18-19
• 1.3.2 组分抗原19-20
• 1.3.3 重组抗原20-22
• 1.3.4 其他抗原22
• 1.4 目的和意义22-23
• 第二章 日本血吸虫沉积虫卵提取方法和间接血凝试验23-33
• 2.1 引言23
• 2.2 实验材料23-25
• 2.2.1 生物材料23-24
• 2.2.2 仪器设备24
• 2.2.3 酶和试剂24
• 2.2.4 试剂配方24-25
• 2.3 实验方法25-27
• 2.3.1 兔人工感染血吸虫尾蚴25
• 2.3.2 肝脏虫卵计数25
• 2.3.3 两种提取虫卵方法比较25-26
• 2.3.4 制备虫卵可溶性抗原26
• 2.3.5 虫卵可溶性抗原包被浓度确定26
• 2.3.6 检测SEA灵敏度26
• 2.3.7 检测SEA敏感性和检出率26
• 2.3.8 SAS软件统计分析26
• 2.3.9 间接血凝诊断试剂建立26-27
• 2.4 结果27-31
• 2.4.1 不同参数下NaOH消蚀法提取虫卵效果27-28
• 2.4.2 提取虫卵两种方法的比较28-29
• 2.4.3 消蚀法提取虫卵制备SEA用于检测血吸虫病29-30
• 2.4.4 虫卵抗原检测的敏感性以及检出率30
• 2.4.5 基于SEA的间接血凝实验30-31
• 2.4.6 IHA检测鼠和兔阴阳性血清结果31
• 2.5 讨论31-33
• 第三章 沉积虫卵主要抗原成分分析33-53
• 3.1 引言33
• 3.2 实验材料33-36
• 3.2.1 生物材料33-34
• 3.2.2 仪器设备34
• 3.2.3 主要试剂34
• 3.2.4 试剂配方34-36
• 3.3 实验方法36-42
• 3.3.1 技术路线36-37
• 3.3.2 虫卵可溶性抗原提取37
• 3.3.3 日本血吸虫阳性血清IgG纯化37-38
• 3.3.4 免疫亲和层析柱的制备及SEA的亲和层析38-39
• 3.3.5 SEA组分的SDS-PAGE银染39-40
• 3.3.6 Dot-blot鉴定免疫亲和层析后的SEA组分40
• 3.3.7 LC-MS鉴定SEA亲和层析组分中的蛋白40-41
• 3.3.8 SEA亲和层析组分蛋白的生物信息学分析41
• 3.3.9 SEA亲和层析组分中糖蛋白分析41-42
• 3.4 结果42-51
• 3.4.1 日本血吸虫阳性血清IgG纯化42
• 3.4.2 SDS-PAGE银染鉴定SEA亲和层析组分42-43
• 3.4.3 Dot-blot鉴定SEA亲和层析组分抗原性43-44
• 3.4.4 LC-MS鉴定SEA亲和层析组分中蛋白44
• 3.4.5 SEA亲和层析组分生物信息学分析44-47
• 3.4.6 SEA亲和层析组分糖蛋白分析47-49
• 3.4.7 SEA亲和层析组分N-端糖基化预测49-51
• 3.5 讨论51-53
• 第四章 日本血吸虫P40的克隆表达及其作为早期诊断抗原的研究53-71
• 4.1 引言53
• 4.2 实验材料53-55
• 4.2.1 生物材料53
• 4.2.2 仪器设备53-54
• 4.2.3 酶和试剂54
• 4.2.4 试剂配方54-55
• 4.3 实验方法55-61
• 4.3.1 SjP40基因克隆及其相关生物信息学分析55-58
• 4.3.2 重组质粒pET-28a(+)-SjP40的构建与鉴定58-59
• 4.3.3 rSjP40的表达与纯化59-60
• 4.3.4 Western Blotting分析rSjP40免疫原性60
• 4.3.5 rSjP40免疫应答分析60-61
• 4.3.6 评估rSjP40作为诊断抗原的应用价值61
• 4.4 实验结果61-69
• 4.4.1 SjP40的克隆及生物信息学分析61-65
• 4.4.2 重组表达质粒pET-28a(+)-SjP40鉴定65-66
• 4.4.3 重组表达质粒pET-28a(+)-SjP40诱导表达66
• 4.4.4 重组表达质粒pET-28a(+)-SjP40纯化66-67
• 4.4.5 Western Blot检测rSjP40免疫原性67
• 4.4.6 rSjP40诱导BALB/c鼠体内的特异性抗体检测67-68
• 4.4.7 rSjP40作为诊断抗原的应用价值68-69
• 4.5 讨论69-71
• 第五章 全文结论71-72
• 参考文献72-80
• 致谢80-81
• 作者简历81

【参考文献】

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本文编号：523523