我国部分地区HIV-1流行及进化动力学研究

发布时间：2017-07-14 22:43

  本文关键词：我国部分地区HIV-1流行及进化动力学研究

  更多相关文章： HIV-1 性传播 基因亚型 系统发育 全长克隆

【摘要】：1989年HIV从缅甸进入云南省静脉吸毒人群(IDUs),之后随着HIV在我国的第一次、第二次爆发流行,HIV向全国传播。据中国疾病预防控制中心(CDC)报告,截止2011年底我国现有存活HIV感染者/AIDS病人共计78万人,全人群感染率0.058%。全国31个省、自治区、直辖市,93%的县、区报告当地有HIV感染者/AIDS病人。伴随着HIV感染者/AIDS病人的活动HIV传遍全国,而不同的活动方式产生了不同的感染人群。我国HIV感染人群可以分为异性性传播人群、男男同性恋人群(MSM)、IDU人群、经血传播人群、母婴传播人群。在我国HIV流行早期以IDU人群、经血传播人群为主,其中经血传播人群主要为有偿献血者。随着国家对HIV防治宣传力度增大,上述两个人群感染HIV比例逐年减少,而性传播成为HIV感染的主要途径。2011年,性传播人群所占全国HIV感染者/AIDS病人比例为75%,其中MSM人群占13%。性传播人群构成复杂,包括异性性传播人群和MSM人群,人群的年龄跨度大、学历跨度大、婚姻情况差异大。多样化的人群特点导致性传播人群中HIV-1毒株基因型呈现复杂的多样性。全国所有HIV-1毒株,包括Thai B亚型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF55_01B、CRF65_cpx等在性传播人群中皆有发现,而且在性传播人群中重组产生多种独特重组型(URF)毒株。北京作为我国首都、国际化大都市拥有数量庞大的MSM群体;河北地处北京与河南之间,早年受到河南有偿献血人群影响HIV从南部传入,近年来当地MSM人群与北京MSM人群之间联系紧密;深圳毗邻香港,是我国最早的经济特区,流动人口数量庞大,2012年发现的新型流行重组毒株CRF55_01B的起源地。本研究利用源自上述3个地区HIV感染者/艾滋病病患者的血浆标本及其产出的病毒基因序列,采用多种生物信息学分析方法,研究这三个地区HIV-1毒株的流行和进化特征,并建立新型重组毒株的感染性克隆,以期阐明我国不同类型地区HIV进化特点和流行情况,并为致病机制研究奠定基础。第一部分北京MSM人群HIV流行动力学研究有研究表明,北京MSM人群中HIV-1的感染率在2002年、2006年、2010年分别为:3.1%、4.8%、6%,这一数据明显高于同期的其他城市和地区。近年来,针对HIV-1在北京MSM人群中流行特征的研究越来越多,但大多是血清学或者一些初步的分子流行病学研究。本研究旨在分析北京MSM人群中流行的HIV-1毒株的流行动力学以及进化特征。整理本实验室从北京市MSM人群HIV感染者的血浆标本中获得的HIV基因序列,自Los Alamos HIV sequence database中下载我国的具有时间、传播途径、地域信息的基因序列,共收集HIV-1 gag基因906位至1446位(540 bp)的基因序列778条,通过最大似然法、Bayesian coalescent理论以及Bayesian Birth-Death理论重建北京MSM人群中流行的HIV-1毒株系统发育关系树、估算突变速率、推断共同祖先株时间(t MRCA)、重建群体动态参数、计算随着时间变化的有效再生数(R0),分析北京MSM人群与其他人群HIV流行的关系,推断进化和流行特征。目的是阐明北京MSM人群中流行的HIV-1不同亚型毒株之间的关系、了解HIV-1在该人群中的动态变化过程,为北京地区MSM人群的行为干预提供切入点,为HIV-1的防控提供基础信息。结果:(1)北京MSM人群中流行的HIV-1毒株包括B、CRF01_AE和CRF07_BC。(2)在全国HIV毒株的ML进化树中,有3个北京MSM簇(系统发育树中分支节点SH值≥90%,序列数量≥40条定义为簇;如果簇中北京MSM人群的序列数最多则定义为北京MSM簇),即B-1簇、01_AE-1簇、01_AE-2簇,MSM人群序列所占的比例分别为72%、64%和41%。在01_AE-1簇内有一个本地簇(01_AE-1-2),其中北京MSM所占的比例(63%)显著高于01_AE-2簇(P=0.002,χ2=9.2972)。(3)B-1簇毒株是经过至少3次传入事件进入北京MSM人群的,传入时间是1991年3月(1984年7月~1997年2月)、1994年1月(1990年5月~1999年3月)和1994年12月(1989年5月~1998年4月)。CRF01_AE毒株进入北京MSM人群是经过两次传入事件,发生时间01_AE-1簇为2000年11月(1999年6月~2002年2月)、01_AE-2簇为2000年6月(1999年4月~2001年6月);值得注意的是在2003年5月(2002年9月~2004年1月)01_AE-1簇内形成一个稳定的本地簇01_AE-1-2簇。(4)01_AE-1簇突变速率高于其他两簇,流行特征重塑分析显示,01_AE-1簇增长持续至2008年,01_AE-1-2簇增长持续至2007年,01_AE-2簇从2003年开始增长持续至2006年。3簇R值(effective reproductive number)在2008年左右后小于1,但是删除01_AE-1-2簇中异性性传播人群序列后R值在2010年出现回升。结论:北京MSM人群中存在多种HIV亚型毒株流行,虽然B亚型毒株传入时间最早,但近年来传播趋势趋于平稳;CRF01_AE毒株传入时间虽然较晚,但增长迅速,对HIV在北京地区的流行具有明显的推动作用。因此对CRF01_AE毒株的防控,对MSM人群采取行之有效的干预措施将有助于减少该地区HIV的流行。第二部分河北省不同高危人群中HIV流行毒株的关系分析河北环抱北京、天津,毗邻河南。2011年,北京、天津MSM人群HIV感染率为6%左右;河南1994-1998年在既往有偿献血人群中爆发HIV感染,该人群的感染率高达15.54%。受北京、天津MSM人群影响,河北某些城市MSM人群HIV感染率达已经到4.8%。而靠近河南的南部地区,有偿献血人群中HIV感染一度形势严峻。据河北CDC提供的数据显示,2005年河北新报告HIV感染者/AIDS病人244例,2010年为431例,2013年为1023例。HIV已经在河北各高危人群间传播,剖析各个流行毒株与不同高危人群之间的关系有助于调整该地区行为干预策略以及疫苗研发策略。在本研究中我们利用从河北不同高危人群中获得的106份HIV-1阳性血浆标本,逆转录PCR扩增获得96份标本的gag、pol全长基因片段并测序,使用phyml 3.0等软件分析病毒在不同人群中的特征以及系统发生关系,以期了解不同高危人群之间传播关系。结果:(1)对亚型分析结果显示B亚型为河北最主要的流行毒株(52.08%),之后依次是CRF01_AE(34.4%)、CRF07_BC(6.3%)、C亚型(4.2%)、CRF02_AG(1.0%)、CRF08_BC(1.0%)以及URF(1.0%)。异性性传播包含所有发现的亚型,不同人群中亚型分布差异具有统计学意义(Fisher精确检验p0.001)。(2)进化关系分析显示河北HIV-1毒株可以分为6簇,分别为:2个B亚型簇,2个CRF01_AE簇,1个CRF07_BC簇和1个C亚型簇,说明河北的HIV-1流行是多次输入导致。河北异性性传播人群分散在各个高危人群之中,自身不独立成簇;各高危人群在进化树中与国内其他地区相同感染途径人群联系紧密。结论:河北发现多种HIV基因型毒株,HIV的流行呈多样性。异性性传播与其他高危人群联系紧密,HIV从高危人群向普通人群扩散。河北HIV毒株的遗传特征将有助于了解我国的HIV分布及进化特点,同时为我国HIV疫苗设计提供序列信息。第三部分深圳市性传播人群中HIV-1流行毒株的多样性研究深圳自1992年发现HIV-1感染者,截止2013年,确诊超过7000例HIV感染者/AIDS患者,2013年的新发感染高出2012年19.2%。深圳主要HIV流行毒株为B亚型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF55_01B、CRF08_BC。异性性传播人群和MSM人群是深圳HIV主要流行人群。2012年在深圳MSM人群中发现新型重组毒株CRF55_01B后,又在北京、安徽、辽宁等地发现该毒株,其以CRF01_AE为骨架与B亚型在深圳MSM人群中重组产生。本研究旨在通过对深圳不同人群中流行的HIV毒株分析,了解深圳现在HIV毒株在人群中的分布特点以及深圳HIV毒株的进化特征。本研究在2013年采集深圳市HIV-1阳性血浆标本250份,逆转录PCR扩增测序获得198份标本的gag/pol全长基因序列,利用gag与pol全长基因使用最大似然法构建系统发育树分析毒株进化特征;使用RIP、genotyping tool、jp HMM-HIV等工具分析URF毒株基因结构。结果:(1)本次研究的深圳HIV感染者以男性为主(87.37%),平均年龄33岁,以异性性传播人群、MSM人群为主。与异性性传播人群相比,MSM人群的平均年龄低(32.5岁)、未婚比例高(81.58%)、学历层次高。(2)亚型分析结果显示CRF01_AE与CRF07_BC占总体的69.7%,其次是由深圳起源的CRF55_01B 26例(13.13%),其他亚型毒株包括B亚型、D亚型、CRF08_BC、CRF59_01B以及在性传播途径中发现的13例URF(6.57%),13例URF毒株有9例是由CRF01_AE、B亚型、C亚型重组而成。异性性传播人群中包含所有流行亚型以及5例URF。(3)进化关系分析显示,深圳MSM人群中CRF01_AE、B亚型毒株系由北京地区传入,而后形成人群内部流行。CRF07_BC毒株中深圳本地MSM人群和本地异性性传播人群关系紧密,不能证明深圳MSM人群与北京MSM人群有直接联系;深圳异性性传播人群与北京地区MSM人群联系紧密。CRF55_01B中MSM人群与异性性传播人群联系紧密,该毒株已经在深圳异性性传播中流行。在CRF01_AE、CRF08_BC中各有一簇由异性性传播人群组成,比较这两簇中异性性传播人群与MSM人群为主的传播簇中异性性传播人群的学历,发现MSM人群为主的传播簇中异性性传播人群普遍年轻、学历较高、未婚。结论:深圳HIV-1毒株基因型具有丰富的多样性,包含中国所有主要流行毒株以及深圳起源的CRF55_01B。性传播人群中丰富的HIV-1基因型使得深圳出现较高比例URF毒株,基因结构相似的两例URF出现提示该毒株可能已经发生传播,对于新型重组毒株的发生和流行应该予以高度警惕。MSM人群中HIV-1毒株已经向异性性传播人群扩散,CRF07_BC毒株、CRF55_01B毒株中MSM人群与异性性传播人群联系紧密,深圳性传播人群HIV-1防控形势极为严峻。异性传播簇中异性传播人群与MSM簇中的异性性传播人群可能属于不同的社会阶层,这个群体可能主要为文化水平低、经济收入低、主要从事体力劳动、活动范围有限的人群,很可能通过低端异性性服务感染。第四部分构建深圳流行HIV-1毒株的全长基因克隆HIV具有高变异性,在研究HIV毒株的致病性、耐药、疫苗中不同亚型之间差异明显。截止到目前,全球所流行的HIV-1毒株除A-D、F-H、J、K亚型外,还有72种流行重组毒株,超过20%的HIV感染者/AIDS病人感染流行重组毒株。现在使用最普遍的感染性克隆是欧美B亚型克隆p NL4-3,欧美B亚型在中国早期流行是主要流行毒株。近年来随着性传播人群的快速增长欧美B亚型在HIV感染者/AIDS病人中所占的比例越来越低,即使是与欧美B亚型同源的Thai B亚型在中国流行HIV-1毒株中所占的比例也显著低于CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC。p NL4-3克隆已经不能满足中国HIV-1毒株研究的需要,对于各个流行亚型HIV-1毒株甚至是URF毒株的感染性克隆需求越来越迫切。然而,比较遗憾的是目前感染性克隆构建的方法还不能普及,获得不同亚型毒株感染性克隆的难度还是很大。我们从3例深圳HIV感染者/AIDS病人的血液样本中提取纯化基因组DNA,扩增获得HIV-1两个半分子序列,然后分别进行T载体连接构建质粒,再使用xho I和Aar I限制性内切酶对两个半分子质粒进行酶切,获得两个目的条带后利用T4连接酶连接,最后转化包装成为全长质粒。将对全长质粒转染293T细胞,ELISA法测定培养上清液中的HIV-1 P24抗原,监测病毒复制。结果:(1)成功构建3个全长克隆(S7 9745bp、S13 9720 bp、S15 9709 bp),S7基因型为CRF55_01B,S13是URF毒株由CRF01_AE和B亚型重组而成,S15也是URF毒株由CRF01_AE、B亚型和C亚型重组而成。(2)S7、S13、S15都是以CRF01_AE为骨架在2953位至3340位插入B亚型片段,虽然在3732位也都插入B亚型片段,但是S7插入的长度要大于S13和15,而S13和S15插入的B片段长度一致。同时S15在1177位至2005位、4345位至4792位插入C亚型片段。(3)对S13和S15的基因片段来源进行分析,S13、S15中B亚型片段全部来自于CRF55_01B,S15中C亚型片段来自于CRF07_BC,而骨架CRF01_AE可能是由CRF55_01B重组而来。(4)经多次转染均未获得具有感染性的包装病毒。结论:获得3株深圳HIV-1毒株的全基因组克隆,由CRF01_AE与B亚型及CRF01_AE、B亚型、C亚型片段重组产生的URF毒株中B亚型片段可能来自CRF55_01B毒株,C亚型片段可能来自于CRF07_BC毒株,而CRF01_AE片段也有可能来自于CRF55_01B毒株。全长克隆方法的构建为进一步构建感染性克隆奠定了基础,也为深圳HIV-1毒株致病性的研究创造了条件。
【关键词】：HIV-1 性传播 基因亚型 系统发育 全长克隆
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.91
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-22
• 第一部分 北京MSM人群HIV流行动力学研究22-43
• 材料和方法23-25
• 结果25-41
• 1. 序列收集和分析数据系列的建立25-26
• 2. 北京MSM人群HIV进化关系分析26-33
• 3. 北京MSM人群HIV进化特征分析33-35
• 4. 北京MSM人群HIV流行特征分析35-41
• 讨论41-42
• 结论42-43
• 第二部分 河北省不同高危人群中HIV流行毒株的关系分析43-57
• 材料和方法43-49
• 结果49-55
• 1. 河北HIV-1 亚型分布49-53
• 2. 不同高危人群中流行HIV-1 毒株系统发育分析53-55
• 讨论55-56
• 结论56-57
• 第三部分 深圳市性传播人群中HIV-1 流行毒株的多样性研究57-78
• 材料和方法58-60
• 结果60-75
• 1. 序列获取以及数据集建立60-63
• 2. 深圳HIV-1 亚型分布分析63-70
• 3. 深圳HIV-1 毒株进化关系分析70-75
• 讨论75-77
• 结论77-78
• 第四部分构建深圳流行HIV-1 毒株的全长基因克隆78-91
• 材料和方法78-85
• 结果85-90
• 讨论90
• 结论90-91
• 参考文献91-98
• 综述 系统发育和贝叶斯理论推断HIV进化及流行98-107
• 参考文献103-107
• 硕士期间发表论文107-108
• 个人简历108-109
• 致谢109

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本文编号：542572