细胞自噬及代谢相关因素在HIV-1 Tat激活中的作用机制研究

发布时间：2017-07-14 23:07

  本文关键词：细胞自噬及代谢相关因素在HIV-1 Tat激活中的作用机制研究

  更多相关文章： Tat 自噬 M2型丙酮酸激酶 腺苷酸活化蛋白激酶 丹参酮II A

【摘要】：人类免疫缺陷病毒(HIV-1)是引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的逆转录病毒。转录激活因子Tat蛋白由HIV-1 tat基因编码,可以反式激活HIV-1的长末端重复序列,在调控HIV-1基因的表达以及生命周期的过程中有重要作用,已经成为抗HIV-1治疗中的一个新的潜在靶点。目前,研究发现自噬及细胞代谢状态在病毒感染过程中有重要作用。本课题主要研究自噬及代谢相关因素在HIV-1 Tat反式激活中的作用及分子机制。丹参酮II A是从传统中药丹参中提炼而来的,它在包括抗肿瘤,抗氧化,抗病毒及抗突变等多种生命活动中发挥重要作用。本课题还探索了传统中药中的有效成分丹参酮II A对代谢的影响,及其对HIV-1 Tat反式激活的影响和涉及的信号通路。实验结果表明,HIV-1 Tat可以通过提高蛋白激酶B(Akt)及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平来激活Akt/mTOR通路,从而抑制自噬相关蛋白ATG7,ATG 5及Beclin 1的表达,PI3K(磷脂酰肌醇3羟激酶)/Akt/mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素(RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以逆转此过程。同时,代谢相关因素M2型丙酮酸激酶(PKM2)及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)可以通过作用于Akt/mTOR通路改变细胞自噬的程度:PKM2表达的降低以及AMPK激活剂AICAR引起的AMPK的活化可以下调Akt和/或mTOR的磷酸化,抑制Akt/mTOR通路,促进自噬相关蛋白ATG 7,ATG 5及Beclin 1的表达,而AMPK的敲除则在上述过程中发挥相反的作用。雷帕霉素,3-甲基腺嘌呤,PKM2的敲除及AMPK的活化会抑制HIV-1 Tat激活;AMPK的敲除会逆转此过程。由此可见,PI3K/Akt/mTOR信号通路,PKM2及AMPK通过对自噬的调控作用于HIV-1 Tat的反式激活。丹参酮II A作为一个典型的抗氧化剂,通过促进促进核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达来改变细胞内的氧化还原状态,逆转Tat引起的活性氧(ROS)的产生及谷胱甘肽(GSH)水平的下降。在细胞中,Tat可以抑制沉默信息调节子2类似物1(SIRT1)蛋白的表达及活性,丹参酮II A的作用可以提高SIRT1蛋白的活性,但此过程并不涉及SIRT1蛋白表达的改变。同时,Tat可以抑制尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)蛋白的表达,并加快烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的消耗,丹参酮II A以剂量依赖的形式逆转此过程;且丹参酮II A的这一作用是通过提高AMPK的磷酸化水平,激活AMPK信号通路介导的。最终,丹参酮II A通过氧化还原调控AMPK-Nampt-SIRT1通路抑制了HIV-1 Tat的反式激活。综上所述,自噬参与调控了HIV-1 Tat的反式激活,而代谢相关因素可以通过调控自噬及Nampt-SIRT1通路来作用于HIV-1 Tat的激活。从自噬以及代谢的角度出发,更加深入地了解宿主细胞-病毒之间相互作用,为我们从另一个新的角度研究抗病毒策略,发展新型抗病毒药物提供了新的方向。
【关键词】：Tat 自噬 M2型丙酮酸激酶 腺苷酸活化蛋白激酶 丹参酮II A
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.91
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩写词8-13
• 第1章 绪论13-27
• 1.1 HIV-1 概况13-16
• 1.1.1 HIV-1 Tat13-14
• 1.1.2 艾滋病治疗现状14-16
• 1.2 细胞自噬16-20
• 1.2.1 细胞自噬概述16
• 1.2.2 自噬的分类16-17
• 1.2.3 自噬的发生17-18
• 1.2.4 细胞自噬与病毒感染研究进展18-20
• 1.3 细胞代谢20-25
• 1.3.1 糖酵解20-21
• 1.3.2 M2型丙酮酸激酶（PKM2）21-22
• 1.3.3 AMPK22-23
• 1.3.4 代谢对自噬的调控23-24
• 1.3.5 病毒感染与细胞代谢的相互作用24-25
• 1.4 研究意义25-27
• 第2章 细胞自噬及代谢调控的自噬在HIV-1 Tat反式激活中的作用机制研究27-55
• 2.1 引言27-28
• 2.2 实验材料28-31
• 2.2.1 实验试剂的配制28-29
• 2.2.2 主要仪器29-30
• 2.2.3 试剂及耗材30
• 2.2.4 引物的设计、合成30
• 2.2.5 菌株及质粒30-31
• 2.3 实验方法31-37
• 2.3.1 质粒转化及甘油菌制备31
• 2.3.2 质粒提取及鉴定31-33
• 2.3.3 细胞培养33
• 2.3.4 细胞转染33-34
• 2.3.5 Real-time PCR检测34-35
• 2.3.6 Western Blot检测35-36
• 2.3.7 MAGI实验36-37
• 2.3.8 统计分析处理方法37
• 2.4 实验结果37-52
• 2.4.1 HIV-1 Tat及PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂对自噬的影响37-41
• 2.4.2 Tat对Akt/mTOR信号通路的作用41-42
• 2.4.3 PKM2对自噬及Akt/mTOR信号通路的影响42-46
• 2.4.4 AMPK对自噬及Akt/mTOR信号通路的影响46-51
• 2.4.5 PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂、PKM2及AMPK对HIV-1 Tat反式激活的影响51-52
• 2.5 讨论52-54
• 2.6 本章小结54-55
• 第3章 丹参酮II A氧化还原调控AMPK/Nampt通路从而抑制HIV-1 Tat激活55-67
• 3.1 引言55
• 3.2 实验材料55-56
• 3.2.1 试剂及耗材55-56
• 3.3 实验方法56-58
• 3.3.1 质粒转化及甘油菌制备56
• 3.3.2 质粒提取及鉴定56
• 3.3.3 细胞培养56
• 3.3.4 细胞转染56
• 3.3.5 NAD+及NAD+/NADH比值检测56-57
• 3.3.6 细胞内GSH水平检测57
• 3.3.7 ROS检测57
• 3.3.8 SIRT1活性检测57-58
• 3.3.9 Real-time PCR58
• 3.3.10 western blot58
• 3.3.11荧光素酶检测58
• 3.3.12统计分析处理方法58
• 3.4 实验结果58-65
• 3.4.1 Tat及丹参酮IIA对细胞内氧化还原状态的影响58-60
• 3.4.2 Tat及丹参酮II A对SIRT1的影响60-61
• 3.4.3 丹参酮II A对Tat处理的细胞中Nampt表达及NAD+水平的影响61-62
• 3.4.4 丹参酮II A诱导的Nampt的表达由AMPK通路介导62-64
• 3.4.5 丹参酮II A通过AMPK-Nampt通路抑制HIV-1 Tat的反式激活64-65
• 3.5 讨论65-66
• 3.6 本章小结66-67
• 结论67-69
• 参考文献69-77
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文77-79
• 致谢79

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本文编号：542664