结核杆菌两个毒力因子CFP-10和ESAT-6协同对宿主细胞的影响及其机制研究

发布时间：2017-07-18 10:05

  本文关键词：结核杆菌两个毒力因子CFP-10和ESAT-6协同对宿主细胞的影响及其机制研究

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【摘要】：结核分枝杆菌在宿主细胞内长期寄生可以引起结核病。小分子分泌蛋白CFP-10和ESAT-6是结核分枝杆菌的毒力因子,在结核分枝杆菌感染和致病的过程中发挥了重要作用。在结核分枝杆菌感染宿主寄生于胞内的过程中,结核分枝杆菌的两个毒力因子CFP-10和ESAT-6在宿主细胞中发挥作用的机制仍不清楚。本课题组前期构建了CFP-10-PEGFP-N1和ESAT-6-PEGFP-N1真核表达载体,分别转染真核细胞,初步观察了两个毒力因子单独作用对宿主细胞凋亡的影响。目的:在前期研究的基础上,本实验采用基因工程技术构建了荷有红色荧光报告基因的CFP-10-PDsRed1-N1,与荷有绿色荧光报告基因的ESAT-6-PEGFP-N1共同转染真核细胞,获得CFP-10基因和ESAT-6基因在同一细胞内表达的细胞模型,进而初步探讨结核分枝杆菌毒力因子CFP-10、ESAT-6协同对细胞凋亡相关基因表达的影响。方法:双酶切CFP-10-PEGFP-N1真核重组表达质粒,获得CFP-10基因片段,将CFP-10基因插入PDs Red1-N1真核表达载体,构建含有红色荧光报告基因的CFP-10-PDsRed1-N1真核重组表达载体。按照以下分组形式:1.PEGFP-N1组2.PDs Red1-N1组3.PEGFP-N1和PDs Red1-N1双转染组4.CFP-10-PDsRed1-N1组5.ESAT-6-PEGFP-N1组6.CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1双转染组7.脂质体组8.空白对照组采用脂质体方法转染293FT细胞,通过倒置荧光显微镜观察转染后细胞出现的荧光情况,用Western Blot方法检测转染后细胞内CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白的表达状况,利用激光共聚焦显微技术观察分析转染后的细胞中CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白共定位的情况。用实时定量PCR技术检测四个凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-8、Caspase-3在转染前后细胞内的动态表达情况。结果:构建获得了序列正确的CFP10-PDsRed1-N1真核重组表达载体;获得了结核分枝杆菌两个毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因共同表达的真核细胞模型,通过倒置荧光显微镜观察,发现转染后的293FT细胞能够分别发出红色荧光和绿色荧光;Western Blot检测结果证实融合蛋白PDSRED-CFP-10和PEGFP-ESAT-6在转染的细胞中获得表达,通过激光共聚焦显微技术观察,又发现转染空质粒PEGFP-N1和PDs Red1-N1组293FT细胞的红色荧光和绿色荧光主要分布在细胞质中,经merge后在细胞的一部分区域的红色荧光和绿色荧光叠加为黄色,另外一部分区域仍保持红色荧光,提示红色荧光与绿色荧光分布不完全一致;转染CFP10-PDs Red1-N1和ESAT6-PEGFP-N1组293FT细胞黄色荧光也分布于细胞质,经merge后在胞质中均为黄色,提示红色荧光与绿色荧光分布一致。采用荧光实时定量PCR检测四个凋亡相关基因在转染前后细胞内的动态表达的结果显示,CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1双转染组的细胞中,转染后24 h的Bcl-2基因的表达量比转染后12 h增加幅度大,转染后24 h的Bax基因的表达量比转染后12 h增加幅度小,且Bax/Bcl-2比率变化呈下降趋势,并在24 h降低幅度大。在CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1双转染组的细胞中,转染后24 h的Caspase-8基因表达量比转染后12 h降低幅度大,与此同时,转染后24 h的Caspase-3基因的相对表达量比转染后12h降低幅度大,且随时间的增加,总体呈现降低的趋势。结论:获得CFP-10-PDs Red1-N1真核重组表达载体能够在真核细胞中正确表达,成功构建了两个毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因在同一细胞内表达的细胞模型,CFP-10基因和ESAT-6基因在同一个细胞内表达互不干扰,其蛋白产物在细胞中的分布是一致的,提示这两个毒力因子在细胞内可能是以复合物的形式存在和发挥作用。采用荧光实时定量PCR对各组细胞进行凋亡相关基因检测,结果发现CFP-10/ESAT-6复合物可能影响细胞内的Bax/Bcl-2比率,使之下降。CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1双转染组和PEGFP-N1和PDs Red1-N1双转染组Caspase-8和Caspase-3基因的相对表达量均降低。
【关键词】：结核分枝杆菌 细胞模型 CFP-10/ESAT-6复合物
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩写词表12-14
• 前言14-15
• 第一部分 结核分枝杆菌毒力因子CFP-10真核重组表达载体的构建15-22
• 1 材料与方法15-18
• 1.1 材料15-16
• 1.2 方法16-18
• 2 结果18-20
• 2.1 CFP-10基因的获得18-19
• 2.2 CFP10PDs Red1-N1真核重组表达载体的构建与鉴定19-20
• 3 讨论20-22
• 第二部分 结核分枝杆菌CFP-10和ESAT-6 真核表达载体双转染真核细胞的观察22-35
• 1 材料与方法23-27
• 1.1 材料23
• 1.2 方法23-27
• 2 结果27-33
• 2.1 待转染质粒的准备结果27
• 2.2 转染后真核细胞 293FT观察结果27-30
• 2.3 CFP-10基因在真核细胞 293FT中表达的Western Blot检测30-31
• 2.4 ESAT-6 基因在真核细胞 293FT中表达的Western Blot检测31
• 2.5 激光共聚焦观察31-33
• 3 讨论33-35
• 第三部分 结核分枝杆菌毒力因子CFP-10、ESAT-6 协同对细胞凋亡相关基因表达影响的检测35-57
• 1 材料与方法35-38
• 1.1 材料36
• 1.2 方法36-38
• 2 结果38-54
• 2.1 总RNA的提取结果38
• 2.2 实时定量PCR法检测基因表达量的结果38-54
• 3 讨论54-57
• 总结57-58
• 文献综述58-65
• 1 结核病的流行病学58-59
• 2 结核分枝杆菌感染的初始阶段59-60
• 3 结核分枝杆菌的生物学特征60
• 4 结核分枝杆菌RD1区及CFP-10和ESAT-6 的相关研究60-65
• 4.1 结核分枝杆菌RD1区60-61
• 4.2 结核分枝杆菌CFP-10和ESAT-6 的相关研究61-65
• 参考文献65-73
• 致谢73-74
• 作者简介74-75
• 导师评阅表75

【参考文献】

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本文编号：557149