蜱传脑炎病毒诊断抗原的筛选及LIPS检测技术的优化

发布时间：2017-08-04 04:25

  本文关键词：蜱传脑炎病毒诊断抗原的筛选及LIPS检测技术的优化

  更多相关文章： TBEV LIPS E蛋白胞外区 稳定细胞系 Nanoluc

【摘要】：蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)是黄病毒科黄病毒属的一种烈性病毒,主要通过蜱虫叮咬传播,可引起严重的临床症状,威胁人类的健康和社会安定。蜱传脑炎病毒主要有欧洲型、西伯利亚型和远东型三种亚型,我国主要为远东型TBEV,致死率约为20%,因此蜱传脑炎病毒感染的临床诊断对疾病的控制和治疗有重要意义。TBEV病毒的基因组是由单股正链RNA构成的,共编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白,其中的包膜糖蛋白(E蛋白)由496个氨基酸构成,包含了天然病毒90%的抗原中和表位,是TBEV感染的检测抗原的首选。目前对TBEV感染血清学检测的抗原,既有通过病毒培养获得的全病毒抗原,也有通过体外表达获得的胞膜糖蛋白片段。本研究表达了含有较多抗原表位的完整E蛋白胞外区,评价了其在TBEV感染血清检测中的效果,并优化了TBEV感染血清检测的一种新型的血清学检测技术-荧光素酶免疫共沉淀(Luciferase immunoprecipitation system,LIPS)。荧光素酶免疫共沉淀是将荧光素酶基因与抗原基因共表达,并由真核表达系统制备检测抗原,通过检测抗原-抗体-琼脂糖凝珠混合物中的荧光素酶活性来判断待检样品中的抗体含量。该方法具有检测灵敏性高、操作简单快捷等优点。本研究的主要内容如下:一 TBEV包膜糖蛋白胞外区密码子的优化、表达及检测效果评价首先本研究对TBEV包膜糖蛋白(E蛋白)的抗原结构域进行了分析,选用TBEV-MDJ01株的E蛋白胞外区(EC)作为TBEV感染血清的检测抗原,并通过LIPS方法评价其检测效果。通过www.jcat.de对EC原始基因序列进行真核密码子优化,由基因合成优化的胞外区基因序列(OPT-EC)。将抗原基因与Rluc(Renilla luciferase)基因进行融合构建重组质粒,瞬时转染真核细胞获得重组抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC。比较优化基因和原始基因的表达量的差异,并将重组抗原用于临床感染血清样本的免疫共沉淀检测(LIPS),以评价抗原的灵敏性和特异性。对获得的重组抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC的荧光活性检测结果显示,真核密码子优化后的胞外区基因(Rluc-OPT-EC)的表达量约是原始基因序列Rluc-EC的12倍。将重组抗原Rluc-OPT-EC用于TBEV感染血清的LIPS检测,OPT-EC的检测灵敏度可以达到86%以上,其对乙型脑炎病毒(JEV)感染血清、黄热病毒(YFV)感染血清、流感病毒(AIV)感染血清和正常人血清的检测特异度高于90%,但是在西尼罗病毒(WNV)感染血清和登革病毒(DENV)感染血清的检测中存在交叉反应。实验证明真核密码子优化能够有效地提高外源蛋白在真核表达系统中的表达量,且优化后的e蛋白胞外区蛋白作为tbev感染的检测抗原,能够有效地区分jev、yfv感染,但是不能区分于wvn和dv感染。二 新型lips检测技术的建立和优化1 构建表达tbev检测抗原的稳定细胞系lips检测中真核表达抗原是通过瞬时转染的方法制备的,存在实验时间长、检测抗原不稳定且需重复制备等问题,为了进一步优化抗原的制备方法,本研究采用慢病毒质粒共转染系统,通过将rluc-ve3和rluc-opt-ec融合基因插入慢病毒载体中构建重组质粒,再将重组质粒与包装质粒共转染293t细胞获得慢病毒包装颗粒。该慢病毒包装颗粒能够感染真核细胞,通过感染cos7细胞,慢病毒将自身基因组整合到细胞基因组中,经过rfp和嘌呤素酶筛选,由单克隆细胞分裂获得能够稳定表达外源蛋白的细胞株,并对细胞株的外源蛋白表达进行验证,分别对其表达产物进行海肾荧光素酶活性检测和tbev感染血清检测。经单克隆筛选获得的稳定表达外源蛋白的细胞株,细胞株具备表达红色荧光蛋白和嘌呤素酶抗性,初步说明慢病毒基因组已整合到细胞基因组中,进一步通过检测海肾荧光素酶和抗原的表达对细胞株进行验证。实验结果显示,稳定细胞株的细胞裂解液中,能够检测到海肾荧光素酶活性,rluc-ve3的荧光强度为5.14×106lu,rluc-opt-ec的荧光强度为4.29×105lu,rluc-ve3的表达量高于rluc-ort-ec,分析原因可能是由于rluc-ort-ec的分子量较大,从而影响其表达量。对稳定表达的重组抗原rluc-ve3进行lips检测,以判断其是否表达有ve3抗原。结果表明重组抗原rluc-ve3在19份tbev感染血清中,检测出13份阳性,检测灵敏度为76.47%(**p0.01),而在实验室前期工作中,通过细胞转染制备的rluc-ve3的tbev阳性检出率79.2%,稳定表达抗原的检出率与该结果相近,说明构建的稳定细胞系cos7-rluc-ve3表达的重组抗原rluc-ve3可用于tbev感染血清的lips检测。本研究中构建了能稳定表达检测抗原的细胞系,简化了抗原制备的方法,降低了实验成本、操作时间,能够持续稳定的为tbev感染血清的检测提供诊断抗原。2 检测标记物的优化-以更为稳定的nanoluc代替rluc在实验操作中,研究发现renillaluciferase的热稳定性不好,在37℃环境中,其荧光素酶活性的半衰期只有10min,在以往的实验中采用的均是室温孵育,而抗原抗体的最佳结合条件是37℃,在该温度条件下可缩短抗原抗体的结合时间,从而使检测更加快速。为了改善renillaluciferase对环境温度的限制,选择了新型的基因工程改造酶nanoluciferase作为lips检测中的标记蛋白,nanoluciferase具备分子量小、荧光信号强且带有N-末端分泌信号等优势,可使真核表达抗原的制备从原来收集细胞裂解液,改善为收集细胞上清液,减少抗原中的杂蛋白成分,提高检测灵敏性。将Nanoluc基因与抗原基因共表达,制备重组抗原Nanoluc-VE3,并对该抗原的荧光素酶活性、热稳定性和作为检测抗原的检测效果进行实验。实验结果表明,成功制备了Nanoluc-VE3重组抗原,从Nanoluc-VE3和Rluc-VE3的热稳定性结果看出,Nanoluc-VE3在37℃和室温条件下,随时间的延长其荧光强度并没有明显变化,说明Nanoluc在37℃和室温的稳定性均良好。对Nanoluc-VE3和Rluc-VE3荧光素酶活性的检测中,Nanoluc-VE3的荧光强度为7.79×109LU,而Rluc-VE3的荧光强度为6.71×106LU,Nanluc-VE3的荧光信号要明显高于Rluc-VE3的荧光信号强度。将Nanoluc-VE3作为检测抗原用于TBEV感染血清的LIPS检测,对30份TBEV感染血清的检测中共检出28份阳性,表明Nanoluc-VE3能够作为检测抗原应用于TBEV感染血清的LIPS检测,在此基础上,重新构建了能够稳定表达重组抗原Nanluc-VE3的稳定细胞株,该细胞株能够持续稳定的向胞外分泌重组抗原Nanluc-VE3,并将其应用于感染血清的检测。稳定表达的Nanluc-VE3对30份TBEV感染血清的检测灵敏度为93.33%,该检测结果高于Rluc-VE3对TBEV感染血清的检测灵敏度(76.47%),说明Nanoluc-VE3的检测信号灵敏度更高,胞外表达的抗原杂蛋白少,检测精准度更高。对JEV和DV感染血清的检测特异性为100%,说明通过稳定细胞系制备的重组抗原Nanoluc-VE3能够用于LIPS检测,因此本部分实验为LIPS检测提供新型的荧光蛋白标签。本研究评价了E蛋白胞外区作为TBEV感染血清检测抗原的检测效果,为TBEV血清学检测的抗原筛选提供了重要的实验依据。并优化了用于TBEV血清检测的荧光素酶-免疫沉淀技术,采用更为稳定、灵敏的Nano Luc荧光作为标记物,制备了稳定表达外源蛋白的细胞系,可使抗原-荧光素酶分泌型表达,使LIPS检测方法更省时更简便。本研究的开展对制备蜱传脑炎病毒感染血清学快速检测试剂具有重要价值。
【关键词】：TBEV LIPS E蛋白胞外区 稳定细胞系 Nanoluc
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.3;R446.6
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-16
• 第一部分 TBEV包膜糖蛋白胞外区密码子的优化、表达及检测效果评价16-38
• 1 材料与方法16-30
• 1.1 材料16-20
• 1.2 实验方法20-30
• 2 实验结果30-35
• 2.1 TBEV包膜糖蛋白胞外区基因的真核密码子优化30-32
• 2.2 PCDNA3.1(+)-RLUC重组质粒的构建32
• 2.3 重组质粒PCDN A3.1(+)-RLUC-EC和PCDN A3.1(+)-RLUC-OPT-EC的构建32-33
• 2.4 重组抗原的荧光素酶活性检测33-34
• 2.5 RLUC-OPT-EC重组抗原对TBEV感染血清的检测34-35
• 3 讨论35-38
• 第二部分 构建表达TBEV检测抗原的稳定细胞系38-50
• 1 材料与方法38-44
• 1.1 材料与仪器38-39
• 1.2 实验方法39-44
• 2 实验结果44-48
• 2.1 重组质粒PCDH-RLUC-OPT-EC和PCDH-RLUC-VE3的构建44-45
• 2.2 慢病毒质粒共转染 293T细胞45
• 2.3 慢病毒感染COS7细胞45-46
• 2.4 稳定细胞系COS7-RLUC-OPT-EC和COS7-RLUC-VE3的鉴定46-47
• 2.5 稳定细胞表达的RLUC-VE3重组抗原的TBEV感染血清的LIPS检测47-48
• 3 讨论48-50
• 第三部分 NANOLUC为检测标签的LIPS检测方法的建立50-59
• 1 材料与方法50-52
• 1.1 材料与仪器50
• 1.2 实验方法50-52
• 2 实验结果52-57
• 2.1 重组质粒PCDN A3.1(+)-NANOLUC-VE3、PCDH-NANOLUC-VE3的构建52
• 2.2 重组抗原NANOLUC-VE3的制备及检测效果评价52-55
• 2.3 稳定表达NANOLUC-VE3的C HO-K1细胞系的构建55-57
• 3 讨论57-59
• 总结59-60
• 参考文献60-64
• 个人简历64-65
• 致谢65

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本文编号：617752