体外研究miR-155在HBV慢性感染中的抗病毒免疫作用

发布时间：2017-08-05 03:00

  本文关键词：体外研究miR-155在HBV慢性感染中的抗病毒免疫作用

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【摘要】：目的：研究miR-155在HBV慢性感染的细胞模型中对免疫应答的调节及其抗HBV作用。方法：1.提取人肝癌细胞株总DNA作为模板,通过PCR扩增miR-155前体序列,酶切后退火连接到pmR-mCherry质粒,构建pmiR-155真核表达载体,然后进行菌落PCR、质粒双酶切和DNA测序鉴定。2.利用脂质体法将pmiR-155真核表达质粒转染到HepG2.2.15细胞,同时设空载组(pmR-mCherry质粒)、转染试剂组、空白组和对照组(HepG2细胞)。转染后24 h荧光显微镜下观察细胞内红色荧光蛋白的表达情况,荧光实时定量PCR检测各组细胞内miR-155表达量。3.重组质粒pmiR-155经去内毒素提取后,转染到人肝癌细胞株。收集转染后各组细胞及细胞培养上清液,应用RT-PCR检测各组SOCS-1 mRNA的变化,Western Blot检测各组SOCS-1蛋白的变化,ELISA检测各组细胞的IFN-Y及IL-2的分泌量变化。4.重组质粒pmiR-155转染到HepG2.2.15细胞,同时设空载组(pmR-mCherry质粒)、转染试剂组、空白组。转染后24h、48h、72h,应用荧光实时定量PCR检测各组细胞内miR-155表达量,化学发光法定量检测细胞培养上清液HBsAg和HBeAg变化,荧光实时定量PCR定量检测HBV DNA拷贝数的变化。结果：1.通过菌落PCR、质粒双酶切及DNA测序鉴定,证实miR-155前体序列成功插入pmR-mcherry真核表达载体,pmiR-155真核表达载体构建成功。2.转染后24h、48h、72h各组细胞进行荧光观察,载体中红色荧光蛋白有较好的表达,转染效率达到50%以上。荧光实时定量PCR结果表明,以空白组为基准,重组载体组细胞内所表达的miR-155明显增加,具有显著意义(P0.05)。3. RT-PCR结果示：重组载体组SOCS-1 mRNA的表达量(0.63±0.09)显著低于空白组(P0.05)；Western Blot结果示：重组载体组内SOCS-1蛋白表达量(0.37±0.07)显著低于空白组(P0.05)；ELISA结果示：以空白组为基准,重组载体组与对照组所分泌的IFN-γ、IL-2水平均显著高于空白组(P0.05),而空载组及转染试剂组与空白组相似。4.化学发光法结果示：以空白组为基准,转染后重组载体组细胞所分泌HBsAg、HBeAg明显减少,而空载组及转染试剂组与空白组相似。转染后48h重组载体细胞内miR-155对HBsAg和HBeAg抑制最为明显,抑制率分别为(83.96±1.52)%和(79.60±8.71)%。荧光实时定量PCR检测结果示：转染后24h、48h、72h,以空白组为基准,重组载体组中HBV DNA拷贝数明显减少,而空载组及转染试剂组未见明显差异。其中重组载体组内miR-155对HBV DNA的抑制率分别为(51.87±0.36)%、(43.67±1.51)%和(68.21±6.02)%。相关性分析发现miR-155与HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达复制呈负相关(r0)。结论：在HBV慢性感染的细胞模型HepG2.2.15中,过表达的miR-155可通过增强抗病毒免疫效应抑制HBV的复制及表达。
【关键词】：乙型肝炎病毒 微小核糖核酸155 细胞因子信号转导抑制因子1 干扰素-γ 白细胞介素-2
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 引言10-12
• 第一章 文献研究12-20
• 1.1 HBV的流行病学12-15
• 1.1.1 HBV的病原学12-13
• 1.1.2 HBV的生命周期13-14
• 1.1.3 HBV与免疫耐受14-15
• 1.1.4 HBV的药物治疗15
• 1.2 RNA干扰15-18
• 1.2.1 siRNA16
• 1.2.2 miRNA16-18
• 1.3 小结18-20
• 第二章 MIR-155真核表达载体的构建、鉴定及表达20-43
• 2.1 实验材料20-23
• 2.1.1 细胞系20
• 2.1.2 菌株与质粒20
• 2.1.3 主要试剂及试剂盒20-21
• 2.1.4 主要溶液的配制21-22
• 2.1.5 主要仪器22-23
• 2.2 实验方法23-32
• 2.2.1 HepG2.2.15细胞基因组DNA提取23-24
• 2.2.2 pmiR-155真核表达质粒的构建24-28
• 2.2.3 pmiR-155真核表达质粒的鉴定28-29
• 2.2.4 pmiR-155真核表达质粒的表达29-32
• 2.2.5 统计分析32
• 2.3 实验结果32-40
• 2.3.1 pmiR-155真核表达载体的构建及鉴定32-35
• 2.3.2 细胞内荧光检测35-36
• 2.3.3 pmiR-155真核表达质粒的表达36-40
• 2.4 讨论40-43
• 2.4.1 人miR-155真核表达载体构建成功40-41
• 2.4.2 重组载体pmiR-155提高细胞内miR-155表达量41-43
• 第三章 MIR-155在HBV慢性感染中调节免疫应答作用43-61
• 3.1 实验材料43-45
• 3.1.1 细胞系及质粒43
• 3.1.2 主要试剂及试剂盒43-44
• 3.1.3 主要溶液的配制44
• 3.1.4 主要仪器44-45
• 3.2 实验方法45-51
• 3.2.1 预测人miR-155靶基因位点45
• 3.2.2 RT-PCR检测各组SOCS-1 mRNA变化45-46
• 3.2.3 Western blot检测各组SOCS-1蛋白变化46-49
• 3.2.4 ELISA检测各组细胞IFN-γ分泌量变化49-50
• 3.2.5 ELISA检测各组细胞IL-2分泌量变化50-51
• 3.2.6 统计分析51
• 3.3 实验结果51-58
• 3.3.1 SOCS-1是miR-155的靶位点51-52
• 3.3.2 miR-155抑制SOCS-1 mRNA表达52-54
• 3.3.3 miR-155抑制SOCS-1蛋白表达54-55
• 3.3.4 miR-155促进IFN-γ和IL-2分泌55-56
• 3.3.5 miR-155与SOCS-1 mRNA和细胞因子的相关性分析56-58
• 3.4 讨论58-61
• 3.4.1 miRNA的免疫调节作用及其对HepG2.2.15细胞中IFN-γ、IL-2的影响58-59
• 3.4.2 miR-155干预SOCS-1对IFN-γ、IL-2的负反馈调节作用59-61
• 第四章 MIR-155对HBV复制及表达的影响61-70
• 4.1 实验材料61-62
• 4.1.1 细胞系及质粒61
• 4.1.2 主要试剂及试剂盒61
• 4.1.3 主要仪器61-62
• 4.2 实验方法62-64
• 4.2.1 人miR-155序列RT-qPCR扩增62
• 4.2.2 乙型肝炎病毒表面抗原定量检测62
• 4.2.3 乙型肝炎病毒e抗原定量检测62-63
• 4.2.4 乙型肝炎病毒核酸定量检测63-64
• 4.2.5 统计分析64
• 4.3 实验结果64-68
• 4.3.1 miR-155对HBsAg和HBeAg的抑制作用64-66
• 4.3.2 miR-155对HBV DNA的抑制作用66-67
• 4.3.3 miR-155和HBV蛋白和HBV DNA的相关性分析67-68
• 4.4 讨论68-70
• 4.4.1 HepG2.2.15细胞与HBV69
• 4.4.2 miR-155抑制HBV的可能机制69-70
• 结语70-72
• 参考文献72-77
• 附录77-83
• 在校期间发表论文情况83-84
• 致谢84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 Xiao-Dong Zhang;Yuan Wang;Li-Hong Ye;;Hepatitis B virus X protein accelerates the development of hepatoma[J];Cancer Biology & Medicine;2014年03期

2 杨海燕;陈光明;崔一民;赵侠;梅川;饶桂荣;莫国玉;杨若才;杨富强;;电脉冲介导的治疗性双质粒HBV DNA疫苗的临床安全性及免疫原性研究[J];解放军医学杂志;2013年03期

3 陈天艳;刘敏;陈云茹;张树林;;HBV宫内传播的研究进展[J];世界华人消化杂志;2007年19期

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本文编号：622826