肺结核病人DNA低甲基化趋势与DNA去甲基化酶的相关性研究
本文关键词：肺结核病人DNA低甲基化趋势与DNA去甲基化酶的相关性研究
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【摘要】：肺结核病(pulmonary tuberculosis, PTB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)感染引起的一种与机体细免疫应答密切相关的慢性感染性疾病,在肺结核病的发病过程中,细胞介导的抗原特异性免疫应答发挥着重要作用。当结核分枝杆菌感染机体时,抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)将结核分枝杆菌抗原通过抗原-MHC分子复合物和CD28-CD80双途径激活T淋巴细胞,同时分泌IL-12、IL-1等细胞因子,进一步刺激免疫细胞释放效应分子如TNF-a等以杀灭结核分枝杆菌。DNA甲基化修饰作为动植物体内一种重要的表观遗传修饰形式,参与免疫应答反应的调控,对肿瘤性疾病、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病的发生发展中起着重要的作用。而DNA甲基化主要通过DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)上调DNA甲基化水平；通过DNA去甲基化酶(TET1、TET2、TET3、TDG)下调DNA甲基化水平,两方面的调节共同维持DNA甲基化水平的高低。课题组在前期通过全基因组DNA甲基化芯片研究发现,肺结核病患者宿主基因普遍呈低DNA甲基化状态。为进一步探索肺结核病人DNA甲基化调节的分子机制、研究肺结核病人DNA低甲基化状态的影响因素,本研究在前期研究结果的基础上,收集健康对照(γ干扰素释放实验,即IGRA阴性)和活动性肺结核病人治疗前全血RNA,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,首先对参与DNA甲基化下调的DNA去甲基化酶的4个基因进行定量检测,以初步明确DNA低甲基化状态与DNA去甲基化酶之间的关系。结果发现,在肺结核病人组中,参与下调DNA甲基化水平的4个基因(TET1、TET2、TET3、TDG)表达均显著升高(p值0.05)。为了全面探讨肺结核病人DNA低甲基化状态的影响因素,我们又对可以被动影响DNA低甲基化状态的DNA甲基化转移酶的3个基因(DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B)进行了定量检测,结果发现：只有)NMT1表达显著升高(p值0.05)。为了进一步验证,我们利用H37Rv裂解抗原以及体外降低DNA甲基化水平的5-氮杂胞嘧啶核苷(5azac)刺激物刺激A549、Beas-2B两种细胞系,并收集刺激后不同时间点细胞DNA、RNA。利用甲基化敏感性限制性分析(MSRA)对所收集DNA样本进行分析,结果表明,H37Rv抗原、5azac导致DNA甲基化水平降低,且刺激时间越长甲基化降低越明显。我们利用Real-time PCR(RT-PCR)方法对RNA样本进行检测。结果显示,在两株细胞中,DNA去甲基化酶随着刺激时间的延长逐渐升高,DNA甲基化转移酶表达的时间动态图却无明显特异性表达。且结果中在刺激第四天A549细胞中H37Rv刺激组DNA去甲基化酶TET2、TET3上调,而在Beas-2B中为H37Rv刺激组DNA去甲基化酶TDG上调,即DNA去甲基化酶表达显著升高,这与临床检测结果相符；在A549细胞H37Rv刺激组有两种DNA甲基化转移酶DNMT3A、DNMT3B上调,而在Beas-2B细胞H37Rv刺激组中表现为DNMT3A下调。综上所述,我们发现无论是临床肺结核病人组还是体外细胞实验H37Rv刺激组,DNA甲基化水平呈下降趋势,而DNA去甲基化酶差异性表达上调。并且在细胞刺激实验中,随刺激时间越长,DNA去甲基化酶表达逐渐升高,而DNA甲基化降低程度逐渐明显。总之,本研究验证了肺结核病人DNA甲基化呈现降低趋势,并初步回答了这种DNA低甲基化趋势可能主要受DNA去甲基化酶调控。
【关键词】：肺结核病 DNA甲基化 DNA去甲基化 DNMTs TETs TDG
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R521
【目录】：
- 摘要5-7
- Abstract7-9
- 缩略词表9-10
- 引言10-21
- 一、肺结核病面临新的挑战,宿主免疫应答能力与肺结核病的密切关联是战胜新挑战的契机11-14
- 二、DNA甲基化对宿主免疫系统起着重要调节作用14-15
- 三、课题组在前期实验中发现肺结核病人呈现DNA低甲基化趋势15-16
- 四、DNA甲基化水平受DNA去甲基化酶及DNA甲基化转移酶调控16-21
- 第一部分 活动性肺结核病人及健康人全血RNA中DNA去甲基化酶及DNA甲基化转移酶表达量的分析21-30
- 一、实验材料和方法21-27
- 二、实验结果27-29
- 三、小结29-30
- 第二部分 体外刺激A549、Beas-2B细胞探讨DNA去甲基化酶及DNA甲基化转移酶对DNA低甲基化趋势的影响30-43
- 一、实验材料和方法30-37
- 二、实验结果37-42
- 三、小结42-43
- 讨论43-46
- 一、肺结核病人DNA去甲基化酶影响DNA低甲基化趋势的相关性分析43-44
- 二、肺结核病人的低甲基化趋势可能通过增强免疫应答来影响疾病的发生发展44-45
- 三、DNA去甲基化酶及DNA甲基化转移酶在同种刺激物刺激过的不同细胞中差异表达的趋势及种类不同45-46
- 结论46-47
- 参考文献47-53
- 致谢53-56
- 个人简历及发表文章56
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，本文编号：644616
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