基于超高速离心浓缩技术的HBV低载量样本检测体系的初步研究

发布时间：2017-08-10 22:22

  本文关键词：基于超高速离心浓缩技术的HBV低载量样本检测体系的初步研究

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【摘要】：背景和目的：乙肝病毒是我国主要的输血传播病原体之一。虽然目前在全国统一开展了核酸检测措施,但仍然存在一定的残余风险。主要因为部分献血者体内病毒载量极低,低于常用的多人份混样检测试剂的灵敏度,加之目前大部分进口试剂的设计不太适合国内的病毒流行株。针对目前出现的问题,本文主要目的是初步研究适合中国流行特征的HBV低载量样本的筛查/定量检测体系。方法：1、选定磁珠法提取体系的成分,通过正交设计表初步确定其浓度或酸碱度,主要包括GuSCN、蛋白酶K、异丙醇及PH;固定其它因素,优化单一成分浓度,最终确定提取体系各成分浓度：选择4种厂家的硅基磁珠,比较不同磁珠的提取效果；确定磁珠种类后,优化磁珠用量。确定提取体系后与成品化提取试剂盒(包括QlAamp(?)DNA Blood Mini Kit及MagPure Viral DNA/RNA Mini KF Kit)进行比较。2、在NCBI的Nucleotide中输入HBV、China、complete genome等关键词找到中国地区的HBV序列,经比对后在保守序列设计引物探针,引物扩增的PCR产物经PMD-19载体连接制备成质粒标准品并测序验证序列,计算质粒拷贝数,并稀释成不同浓度的质粒标准品,购买第三方标准品对质粒标准品进行校正,绘制HBV标准曲线,并用Probit分析计算检测下限,验证灵敏度、特异性等。将建立好的HBV荧光定量检测方法检测100例样本,并与罗氏cobas(?)TaqScreen MPX Test, version 2.0检测试剂盒检测结果进行相关性分析。3、用HBV阴性血浆稀释HBV标准品,制成低拷贝样本：固定离心时间,研究不同离心力与病毒回收率的关系：固定离心力,研究离心时间对回收率的影响：最后使用低载量样本对超高速浓缩技术进行验证并评估其应用价值。结果：1、提取体系的优化结果：GuSCN浓度2.0M,蛋白酶K浓度为0.89mg/ml,异丙醇35%,PH为8；磁珠的选择：A磁珠；磁珠用量：30ul。建立的磁珠提取系统在高、中、低三个浓度的提取效率与两种试剂盒比较均有统计学差异。2、建立的HBV检测体系引物探针特异性好,质粒测序结果完全吻合,标准品曲线R20.999,扩增效率为92.75%,线性范围为5.0x101-2.5x109IU/mL,95%检测下限为16.2IU/mL,批内重复变异系数为0.15%-1.11%,批间变异系数为0.91%-4.67%。与罗氏检测结果相关关系为y=0.916x+2.186,(R=0.96；P0.001)3、当离心力在15000g-90800g时,HBV病毒回收率从41.43%增加至88.29%；当离心力在为90800g-138900g时,HBV病毒回收率相对稳定在80%-90%之间;当离心力在138900g-171000g时,HBV病毒回收率从88.29%下降至62.94%。离心时间为0.5h、1h、1.5h及2h时,其回收分别为88.31%、89.70%、88.40%、75.62%。运用浓缩技术后,发现8例cobas(?)TaqScreen MPX Test,version 20漏检样本。11、将超高速离心浓缩技术与本实验建立的HBV检测体系结合时,单个样本取样量不少于2ml时(N人份混检时,每个样本取2ml混合,共N*2ml),离心浓缩后灵敏度可达2IU/mL;单个样本取样量不少于4ml时(N人份混检时,每个样本取4ml混合,共N*4ml),灵敏度可达1IU/mL。结论：1、通过优化提取试剂成分及浓度,成功建立起实验室血浆HBV病毒核酸的磁珠提取体系。2、建立了适合中国HBV病毒流行特征的HBV荧光定量检测体系。3、建立了基于超高速离心浓缩的HBV检测方法,提高病毒检出率。
【关键词】：HBV 磁珠法核酸提取 荧光定量PCR 超高速离心 病毒浓缩
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62;R446.6
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 引言10-12
• 第一章：磁珠法提取血浆HBV核酸的体系建立12-27
• 1. 前言12-13
• 2. 材料与方法13-19
• 2.1 材料13-14
• 2.2 方法14-19
• 3. 结果19-25
• 3.1 磁珠法提取血浆HBV病毒实验条件优化结果19-24
• 3.2 磁珠提取方法与商品化提取试剂盒的比较结果24-25
• 4. 讨论25-27
• 第二章：特异性引物及探针的筛选、HBV荧光定量PCR检测方法的建立、与商品化试剂盒的比较27-38
• 1. 前言27-28
• 2. 材料与方法28-31
• 2.1 材料28
• 2.2 方法28-31
• 3. 结果31-35
• 3.1 HBV引物的特异性31
• 3.2 重组质粒的扩增结果及测序验证31-32
• 3.3 标准曲线绘制32
• 3.4 重复性评价32-33
• 3.5 最低检测线(LOD)的确立33
• 3.6 灵敏度的验证33
• 3.7 临床特异性的验证33-34
• 3.8 与罗氏cobas(?)TaqScreen MPX Test,version 2.0检测试剂盒的性能比较34-35
• 4. 讨论35-38
• 第三章：超高速离心技术浓缩HBV病毒的效果及应用38-51
• 1. 前言38-39
• 2. 材料与方法39-42
• 2.1 材料39
• 2.2 方法39-42
• 3. 结果42-47
• 3.1 不同离心力的检测结果及回收率(%)42-45
• 3.2 不同离心时间的检测结果及回收率(%)45
• 3.3 超高速离心浓缩后的灵敏度验证结果45-46
• 3.4 4例漏检样本的验证结果46
• 3.5 42例HbsAg阴性、Anti-HBc阳性、NAT阴性样本浓缩前后对比结果46-47
• 4. 讨论47-51
• 第四章: 结论51-52
• 参考文袱52-56
• 文献综述 核酸提取方法的进展56-68
• 参考文献65-68
• 已发表文章68-69
• 致谢69-70

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本文编号：652996