人热休克蛋白HSP70与HBVPreS1相互作用的研究

发布时间：2017-08-11 04:02

  本文关键词：人热休克蛋白HSP70与HBVPreS1相互作用的研究

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【摘要】：目的以HSP70与PreS1的相互作用为基础,以HSP70参与调控HBV病毒分泌作为研究对象,阐明HSP70在包浆内引导HBV病毒颗粒向细胞膜转运和分泌的机制,同时为开发以阻断HBV分泌的新型抗病毒药奠定基础。方法1)分子克隆技术构建pW28-HSP70原核表达质粒,在大肠杆菌(Eecherichia coli,E.coli)B834中获得可溶性上清表达,通过蛋白纯化技术纯化。分子克隆技术构建HSP70腺病毒,构建稳定表达HSP70的肝癌细胞系。2)构建PreS1截断片段质粒,获得GST-PreS1X1,GST-PreS1X2,GST-PreS1X3融合蛋白,Pull down实验初步探究HSP70与PreS1的结合位点。3)进一步将PreS1截断为氨基酸残基,获得GST-PreS1Δ1-13,GST-PreS1Δ1-44,GST-PreS1Δ16-27,GST-PreS1Δ21-33,GS T-PreS1-Δ21-47,GST-PreS1Δ31-47,GST-PreS1Δ41-53融合蛋白,通过微量热泳动技术(Microscale Thermophoresis,MST)找出在HSP70与PreS1在相互结合中发挥重要作用的位点。4)通过定点突变技术获得hsp70突变体,表达纯化突变型蛋白。孔雀绿定磷法检测野生型及突变型hsp70的atpase活性。5)通过qrt-pcr,westernblot检测肝癌细胞系中hbv对hsp70的影响;检测hsp70对hbv的转录及蛋白表达水平的影响。6)通过qrt-pcr,westernblot,elisa检测hsp70在hepg2.2.15及ad38细胞系中,对hbv分泌水平的影响。7)通过高通量测序筛选与hbv分泌相关因子探究hbv分泌相关机制。结果1)pw28-hsp70重组质粒在e.coli中获得可溶性上清表达。经纯化hsp70蛋白纯度达85%以上。成功构建pad-hsp70重组腺病毒,并在hepg2.2.15中稳定表达。2)获得纯度90%以上的gst-pres1x1,gst-pres1x2,gst-pres1x3融合蛋白,pulldown实验证实hsp70蛋白能够与gst-pres1x1,gst-pres1x2,gst-pres1x3蛋白分别结合。3)pres1的30-45个氨基酸残基在与hsp70的结合中起着关键作用。4)获得三种突变型hsp70蛋白,分别为mutant-thr38,mutant-thr229,mutant-ser300。野生型hsp70蛋白的atpase在37℃,tris hcl(ph8.0)等条件下具有较好的活性。野生型hsp70蛋白atpase活性显著高于突变体,其检测结果具有统计学意义。5)qrt-pcr结果显示,hbv可以引起hsp70mrna水平增高,western blot显示HBV可以引起HSP70蛋白表达增加;同时HSP70可以抑制HBV的转录水平,HSP70降低HBV蛋白表达水平。6)qRT-PCR,western blot及ELISA结果显示HSP70在一定程度上增加了表达HBV的肝癌细胞中HBV分泌量。7)高通量测序筛选出部分与HBV分泌相关因子。结论PreS1的30-45氨基酸在与HSP70的结合过程中发挥重要作用;HSP70具有ATPase活性;HSP70能够介导HBV分泌。
【关键词】：HSP70 HBV PreS1 pull down MTS ATPase活性 分泌
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一章 热休克蛋白家族HSP70蛋白表达，纯化及其与HBV的Pre S1的相互作用14-42
• 第一节 HSP70的克隆，表达，，纯化15-26
• 1 材料与方法15-22
• 2 结果22-24
• 3 讨论24-26
• 第二节 Pre S1截断片段与HSP70的结合实验26-31
• 1 材料与方法26-28
• 2 结果28-30
• 3 讨论30-31
• 第三节 HSP70的ATP酶活性检测31-40
• 1 材料与方法31-36
• 2 结果36-38
• 3 讨论38-40
• 参考文献40-42
• 第二章 HSP70介导HBV分泌的研究42-71
• 第一节 过表达HSP70腺病毒的构建42-49
• 1 材料与方法42-45
• 2 结果45-48
• 3 讨论48-49
• 第二节 HSP70在HBV复制过程中的相关研究49-57
• 1 材料和方法49-52
• 2 结果52-55
• 3 讨论55-57
• 第三节 HSP70在HBV分泌过程中的相关研究57-68
• 1 材料与方法57-60
• 2 结果60-66
• 3 讨论66-68
• 参考文献68-71
• 全文总结71-73
• 文献综述73-80
• 参考文献76-80
• 致谢80-81
• 发表的论文、参加的学术会议及参与的科研项目81

【参考文献】

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1 徐倩倩;张小敏;景娇;师保浚;王世旗;周斌;陈溥言;;热休克蛋白70促进猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果[J];病毒学报;2015年04期

本文编号：654082