弓形虫GRA15_Ⅱ效应分子诱导的巨噬细胞极化抑制日本血吸虫病肝纤维化的研究

发布时间：2017-08-12 22:16

  本文关键词：弓形虫GRA15_Ⅱ效应分子诱导的巨噬细胞极化抑制日本血吸虫病肝纤维化的研究

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【摘要】：背景：血吸虫病被世界卫生组织列为17种被忽视的热带疾病之一。在中国,日本血吸虫病广泛流行,主要分布于长江流域及其以南广大地区。有研究显示,宿主感染日本血吸虫后4周内以Th1应答为主,随后产生的虫卵沉积在肝脏的微血管,诱导强烈的肉芽肿反应,机体免疫状态逐渐转变为Th2应答,由此促进了肝脏纤维化乃至肝硬化的发生。肝脏巨噬细胞,亦即枯否细胞(kupffer cells)是肉芽肿的主要组成细胞。处于不同激活状态的巨噬细胞分别具有促进(或限制)炎症和纤维化的作用,其中经典激活的巨噬细胞(Classically activated macrophages, CAMs,或M1)减轻血吸虫病肝纤维化,而选择激活的巨噬细胞(Alternatively activated macrophages, AAMs,或M2))却起着促进纤维化病理进程的作用。刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种机会致病性的专性有核细胞内寄生原虫,拥有十分广泛的宿主。弓形虫具有不同的基因型,分布在北美和欧洲的弓形虫主要分为三种基因型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型；而我国则以Chinese 1(ToxoDB#9)型弓形虫最为常见。弓形虫分泌的多态性效应蛋白与其自身毒力和宿主信号通路的调节有关,其中致密颗粒蛋白15(Dense-granule proteinl5, GRA15)和棒状体蛋白16(Rhoptry proteins 16, ROP16)可显著影响弓形虫对小鼠的致病性和宿主细胞信号转导。研究报道,II型弓形虫的多态性效应分子GRA15 (GRA15Ⅱ)可诱导巨噬细胞向M1极化,而I型或III型弓形虫ROP16 (ROP16Ⅰ/Ⅲ)使其向M2偏移。而Chinese 1基因型虫株兼具有效应分子GRA15n和ROP16Ⅰ/Ⅲ。目的：验证GRA15Ⅱ或ROP16Ⅰ/Ⅲ稳转后的小鼠巨噬细胞系极化方向,及其对肝星状细胞纤维化相关蛋白分泌的影响,并且探讨其对小鼠肝纤维化及机体免疫状态的影响。方法：利用慢病毒包装的重组质粒导入小鼠巨噬细胞RAW264.7后构建稳转细胞系GRA15Ⅱ-RAW264.7、ROP16Ⅰ/Ⅲ-RAW264.7和]LV-RAW264.7。通过ELISA和qRT-PCR分别检测细胞培养上清液和细胞mRAN的TNF-α、IL-4、IL6、IL-10、IL12p40和TGF-β1细胞因子表达水平,WB和qRT-PCR检测细胞iNOS和Arg-1的表达,Griess法和尿素法分别检测细胞培养上清中NO和Urea的含量,验证巨噬细胞的极化方向。将上述三种稳转细胞系及正常对照RAW264.7四种细胞体外与小鼠肝星状细胞系JS1共培养,qRT-PCR和WB检测JS1的α-SMA、Col I和TGF-β1表达水平差异。构建感染日本血吸虫尾蚴的Balb/c小鼠模型,分为四组,在感染尾蚴前一周及感染尾蚴当天各组分别尾静脉输注含2×106GRA15n-RAW264.7、 LV-RAW264.7,RAW264.7和无细胞的150 u1 PBS溶液。感染尾蚴后第八周处死小鼠,检测肝脏虫卵数,HE,Masson,免疫组化(α-SMA, ColⅠ, MMP13和TGF-β1),肝匀浆(Hyp,α-SMA, ColⅠ, MMP13, iNOS和Arg-1),mRNA (α-SMA, ColI,MMP13,TGF-β1, MMP13, iNOS和Arg-1)；血清HA和细胞因子(IL-4,IL10,TNF-α, IFN-γ);脾脏淋巴细胞培养上清和mRNA细胞因子(IL-4,IL10,TNF-α,IFN-γ).结果：(1)稳转细胞系GRA15Ⅱ-RAW264.7的iNOS、TNF-α和IL12p40高表达,提示巨噬细胞向M1偏移；而ROP16Ⅰ/Ⅲ-RAW264.7的Arg-1、IL-10和TGF-β1高表达,显示巨噬细胞向M2偏移。(2)GRA15n-RAW264.7与JS1共培养后,其抑制纤维化相关蛋白a-SMA和ColI的表达,而ROP16Ⅰ/Ⅲ-RAW264.7与其共培养后作用相反。(3)GRA15Ⅱ-RAW264.7体内干预实验组,肝脏HA,Hyp,α-SMA, ColⅠ和TGF-β1的表达下降,肝脏虫卵计数减少,肝脏纤维化程度减轻。(4)GRA15Ⅱ-RAW264.7干预组Thl免疫反应增强,肝脏MMP13,iNOS表达增加,脾脏淋巴细胞和血清Thl细胞因子(TNF-α和IFN-γ)表达上调,Th2细胞因子(IL-4和IL10)表达下降。结论：本研究结果显示,GRA15n和ROP16Ⅰ/Ⅲ是介导小鼠巨噬细胞极化的重要虫源性效应分子,可以分别使巨噬细胞向M1和M2方向极化。GRA15Ⅱ诱导的巨噬细胞体外可显著抑制肝星状细胞纤维化相关蛋白的表达,体内预先输注干预可明显减轻日本血吸虫病肝纤维化程度。此研究发现可更好的深入理解M2/Th2为主介导的血吸虫病肝纤维化机制,并提供一个寄生虫来源的无毒性多肽制剂定向诱导巨噬细胞M1偏移活化,从而为探索治疗纤维化疾病的新策略提供线索。
【关键词】：弓形虫 GRA15_Ⅱ ROP16_(Ⅰ/Ⅲ) 日本血吸虫 纤维化
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R532.21;R575.2
【目录】：

• 英文缩略词对照表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 1、前言15-20
• 2、材料与方法20-40
• 3、结果40-50
• 4、讨论50-53
• 5、结论53-54
• 6、参考文献54-61
• 1、个人简历61-63
• 2、致谢63-64
• 3、综述64-78
• 参考文献72-78

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本文编号：663902