IL-22在细粒棘球蚴感染早期表达情况的初步研究

发布时间：2017-08-20 16:22

  本文关键词：IL-22在细粒棘球蚴感染早期表达情况的初步研究

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【摘要】：目的通过体外原头蚴与小鼠脾细胞共培养及体内建立细粒棘球蚴感染小鼠动物模型,观察细粒棘球蚴感染早期对小鼠脾细胞产生IL-22表达情况的影响及对主要产生IL-22的CD4~+T细胞比例变化的探讨,从而分析其在细粒棘球蚴感染早期免疫逃逸机制。方法1.体外实验无菌取BALB/c小鼠脾细胞,分别加入不同浓度原头蚴及囊液共培养48h,ELISA检测培养上清液中IL-22表达量及实时定量PCR检测脾细胞IL-22m RNA的相对表达量。同浓度原头蚴及囊液分别在0h、12h、24h、36h和48h收集细胞,通过流式细胞术检测CD4~+IL-22~+T细胞比例变化。1640培养基与脾细胞共培养设为对照组。2.体内实验建立小鼠细粒棘球蚴感染模型,BALB/c小鼠6-8周,22±2g,实验组小鼠腹腔接种活性良好体积为0.2ml的原头蚴2000个/只,腹腔注射同等体积无菌PBS为对照组;分别于第3、6、9、12天处死小鼠,收集外周血并分离脾细胞收集肝组织和肠管组织。用流式细胞仪检测脾细胞中T淋巴细胞亚群Th1、Th17以及Th22比例变化;通过实时定量PCR法检测IL-22、IL-22R1、IFN-γ、IL-17以及相关转录因子Ahr、T-bet、RORγτm RNA和TGF-β1 m RNA的相对表达量;ELISA检测血清中IL-22、IFN-γ、IL-17及TGF-β1的蛋白表达水平。结果1体外试验ELISA和q RT-PCR检测显示在原头蚴为1000个/ml和囊液蛋白浓度为2.05mg/ml时脾细胞产生IL-22增加;与对照组相比,流式细胞术检测原头蚴组及囊液组CD4~+IL-22~+T细胞比例随作用时间的延长而逐渐增加,差异有统计学意义。2体内试验(1)与对照组相比,ELISA检测细粒棘球蚴感染小鼠血清中IFN-γ在感染后第6、9天升高(P0.05);q RT-PCR检测小鼠脾细胞IFN-γ及Th1型细胞重要转录因子T-bet的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式细胞仪检测小鼠脾细胞中CD4~+IFN-γ~+T细胞(Th1细胞)在感染后第6、9天升高(P0.05)。(2)与对照组相比,ELISA检测细粒棘球蚴感染小鼠血清中IL-17A在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);q RT-PCR检测小鼠脾细胞IL-17及Th17型细胞重要转录因子RORγτ的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式细胞仪检测小鼠脾细胞中CD4~+IFN-γ-IL-17~+IL-22~+T细胞(Th17细胞)在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。(3)与对照组相比,ELISA检测细粒棘球蚴感染小鼠血清中IL-22在感染后第3、6、9天升高(P0.05);q RT-PCR检测小鼠脾细胞IL-22及Th22型细胞重要转录因子Ahr的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式细胞仪检测小鼠脾细胞中CD4~+IFN-γ-IL-17-IL-22~+T细胞(Th22细胞)在感染后第6、9天升高(P0.05)。(4)与对照组相比,q RT-PCR检测小鼠肝脏及肠管组织细胞IL-22R1的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。ELISA检测细粒棘球蚴感染小鼠血清中TGF-β在感染后第3、6、9及12天升高(P0.05);q RT-PCR检测小鼠脾细胞TGF-β的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。结论1.原头蚴及囊液均可促进小鼠脾细胞产生IL-22,提示IL-22可能参与宿主防御细粒棘球蚴感染。2.在小鼠细粒棘球蚴感染早期,主要产生IL-22的CD4~+T细胞,包括Th1、Th17以及Th22细胞均增加可能参与了宿主的免疫抗寄生虫防御反应。
【关键词】：细粒棘球蚴 IL-22 Th22 Th17 Th1
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R532.32
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-17
• 第一部分 初步探讨体外囊液和原头蚴对小鼠脾细胞产生IL-22的影响17-33
• 1 材料17-18
• 1.1 主要仪器和试剂17-18
• 1.2 细粒棘球蚴采集及小鼠来源18
• 2 方法18-27
• 2.1 原头蚴制备18-19
• 2.2 小鼠脾细胞悬液制备19-20
• 2.3 主要溶剂配制及保存20-21
• 2.4 建立体外细粒棘球蚴及囊液感染小鼠细胞模型21
• 2.5 检测ELISA细粒棘球蚴感染小鼠脾细胞细胞培养上清中IL-22表达量21-22
• 2.6 流式细胞染色和检测22
• 2.7 试剂盒提取检测细粒棘球蚴感染小鼠脾细胞总RNA22-23
• 2.8 RNA逆转录合成cDNA23
• 2.9 PCR反应23-25
• 2.10 实时荧光定量PCR检测细粒棘球蚴对小鼠脾细胞IL-22基因表达25-26
• 2.11 统计学分析26-27
• 3 结果27-32
• 3.1 不同浓度原头蚴对小鼠脾细胞分泌IL-22及IL-22mRNA表达的影响27-28
• 3.2 不同蛋白浓度囊液对小鼠脾细胞IL-22分泌及IL-22mRNA表达的影响28-30
• 3.3 不同作用时间原头蚴对小鼠脾细胞CD4~+IL-22~+T细胞比例的影响30-31
• 3.4 不同作用时间囊液刺激小鼠脾细胞CD4~+ IL-22~+ T细胞比例增加31-32
• 4 讨论32-33
• 第二部分 细粒棘球蚴感染早期阶段IL-22表达的初步分析33-56
• 1 材料和试剂33-34
• 2 方法34-41
• 2.1 细粒棘球蚴采集、形态观察、活性鉴定同第一部分34
• 2.2 细粒棘球蚴感染动物模型建立34
• 2.3 小鼠脾细胞制备同第一部分34
• 2.4 流式细胞检测CD4~+ IFN-γ~+、CD4~+ IFN-γ- IL-22~+ IL17、CD4~+ IFN-γ- IL-22~+ IL-17~+步骤34-35
• 2.5 小鼠肝及肠细胞总RNA提取35
• 2.6 PCR反应35-38
• 2.7 ELISA法检测细粒棘球蚴早期感染小鼠外周血中各炎症相关细胞因子含量38-40
• 2.8 统计学分析同第一部分40-41
• 3 结果41-54
• 3.1 细粒棘球蚴感染模型早期小鼠脾细胞产生IL-22相关CD4~+T细胞变化41-42
• 3.2 细粒棘球蚴感染早期Th1细胞比例升高42-44
• 3.3 细粒棘球蚴感染早期Th17细胞比例升高44-47
• 3.4 细粒棘球蚴感染早期Th22细胞比例升高47-49
• 3.5 细粒棘球蚴感染早期肝脏及肠管IL-22R1 m RNA表达水平增加49-51
• 3.6 细粒棘球蚴感染早期TGF-β1 表达升高51-52
• 3.7 体外加入重组细胞因子IL-22促进感染小鼠脾细胞IFN-γ的表达52-54
• 4 讨论54-56
• 4.1 Th1细胞、细胞因子IFN-γ以及其主要转录因子T-bet在细粒棘球蚴感染早期的变化54
• 4.2 Th17 细胞、细胞因子 IL-17 以及转录因子 RORγι在细粒棘球蚴感染早期的变化54-55
• 4.3 Th22 细胞、细胞因子 IL-22、IL-22R1 以及转录因子 Ahr 在细粒棘球蚴感染早期变化55
• 4.4 TGF-β在细粒棘球蚴感染早期阶段的表达水平55-56
• 4.5 体外加入重组细胞因子 IL-22 促进感染小鼠脾细胞 IFN-γ的表达56
• 结论56-57
• 参考文献57-61
• 文献综述61-70
• 参考文献66-70
• 致谢70-71
• 作者简介71-72
• 导师评阅表72

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本文编号：707645