日本血吸虫热休克蛋白超家族及其在尾蚴入侵阶段应激反应的初步分析研究

发布时间：2017-08-21 14:10

  本文关键词：日本血吸虫热休克蛋白超家族及其在尾蚴入侵阶段应激反应的初步分析研究

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【摘要】：自古以来,血吸虫病作为一种经疫水传播的疾病不断地危害人类的健康,它的病原生物血吸虫有着特殊的传播过程和感染过程,在血吸虫的生活史中,螺和哺乳动物分别是它的中间宿主和终宿主,在血吸虫感染宿主及在宿主体内发育繁殖的过程中,血吸虫需要具备识别,入侵,抗应激的能力。血吸虫是多细胞的动物,隶属于吸虫,雌雄异体,寄生生活。在寄生过程中,宿主可以产生对虫体的抵抗作用。研究表明,在流行区人群对血吸虫具有一定的免疫保护力；东方田鼠可以对血吸虫完全抵抗；易感动物对致弱尾蚴免疫感染后可产生对再次感染的抵抗作用。宿主的免疫对于血吸虫生存是一个挑战。血吸虫的抗应激与宿主的免疫攻击是研究不同结局的重要因素,对于这方面的阐述和研究将有助于更深入的了解宿主与血吸虫的相互关系。一日本血吸虫热休克蛋白及其在正常尾蚴和致弱尾蚴的表达差异目的致弱尾蚴初次免疫小鼠后能够产生对于再次感染的抵抗能力,这跟致弱尾蚴经紫外线照射后某些分子或者结构的变化可能有关系,热休克蛋白在血吸虫的自我防御中发挥着重要的作用。本章节研究血吸虫的热休克蛋白系统,同时研究热休克蛋白在正常尾蚴和致弱尾蚴当中表达量的改变,以期能够探索致弱尾蚴免疫效果的机制。方法1、通过搜索KEGG数据库,找出HSPs参与的主要的生物学通路和生物学过程；2、在日本血吸虫中,充分挖掘NCBI当中日本血吸虫的热休克蛋白的基因序列；3、依据是按照分子量的大小,序列的结构域分析及细胞的不同部位对日本血吸虫的热休克蛋白进行分类；用MEGA软件进行进化树的构建,用DNAMAN软件进行序列比对,比较热休克蛋白的分子进化,比较日本血吸虫,曼氏血吸虫,秀丽隐杆线虫,小鼠和人之间热休克蛋白的同源关系；4、通过特定的紫外光的照射,构建日本血吸虫致弱尾蚴的模型,分别用正常尾蚴和致弱尾蚴感染小鼠皮肤,在两个不同的时间(感染后1小时和感染后2.5小时)取下皮肤,用感染了血吸虫的小鼠皮肤来进行RNA的提取和后续的实验；5、按照热休克蛋白的家族分类和它们分布的不同细胞部位,挑选了十二个重要的热休克蛋白及热休克因子,用qPCR来观察它们在正常尾蚴感染小鼠皮肤和致弱尾蚴感染小鼠皮肤后表达量的变化；6、制备血吸虫感染皮肤样本的石蜡切片,HE染色观察皮肤期童虫在正常和致弱组中形态的变化,进一步用间接免疫荧光技术看SjP40在尾蚴当中的表达和定位情况；7、统计学采用SPSS19.0统计软件进行分析,P0.05表示差异有统计学意义。结果1、生物信息学分析发现日本血吸虫有着众多的热休克蛋白,这些热休克蛋白可以分为HSP70家族,HSP90家族,HSP40家族,小热休克蛋白家族,HSP60和HSP10；家族内部有分布在不同细胞部位的热休克蛋白分子。同时日本血吸虫也有HSF。2、热休克蛋白70家族根据结构域、功能及细胞定位的不同,可以分为HSPA5、 HSPA8、HSPA9及HSP110；热休克蛋白90家族根据结构域、功能及细胞定位的不同可以分为HSP83, Gp96和TRAP。3、日本血吸虫的热休克蛋白跟曼氏血吸虫的热休克蛋白同源性比较接近,其次是宿主小鼠和人,最后是秀丽隐杆线虫。4、正常尾蚴和致弱尾蚴入侵小鼠皮肤后热休克蛋白都会升高,但是致弱尾蚴升高的幅度比正常尾蚴的要小,特别是在基础表达量高的基因如HSPA8, P40和HSP90中,它们之间的差别有统计学意义。5、致弱尾蚴经过紫外线照射后,虫体的形态有所改变。结论1、日本血吸虫拥有完整的热休克蛋白体系,它们分布于不同部位,有着不同的功能,能够通过相互作用组成一个应激的整体,发挥着蛋白转运,折叠,修复,降解的功能,这是日本血吸虫抵抗外界刺激和宿主攻击的基础。2、正常尾蚴和致弱尾蚴在热休克蛋白的表达上,两者在入侵小鼠皮肤时都会升高,但致弱尾蚴升高的幅度没有正常的大,这可能会影响到热休克蛋白的防御应激反应。二日本血吸虫热休克因子基因结构特征及其可变剪切亚型分析研究目的热休克因子作为经典的转录因子通过结合热休克蛋白上游的热休克原件进而调控热休克反应。但是日本血吸虫的热休克因子没有报道,本章首次进行日本血吸虫热休克因子的克隆,鉴定,并分析其基因结构特征和可变剪切亚型。为研究热休克因子及其调控提供基础。方法1、日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔,42dpi灌注法收集雌虫、雄虫及感染兔肝脏,Trizol法提取总RNA；2、自日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵总RNA RT-PCR扩增以获得Sj-hsf ORF全长片段和Sj-hsf可变剪切区域片段,进行克隆、酶切及测序鉴定；3、用DNAMAN8.0、InterPrco、Mega6结合日本血吸虫和曼氏血吸虫基因组数据库以及GenBank等网络分析平台,深入分析Sj-hsf的基因结构特征、可变剪切模式,与不同物种HSF序列的同源性、功能结构域和进化树结果1、自雌虫、雄虫、虫卵扩增、克隆获得阳性重组质粒,其中含Sj-hsf ORF的pBSjHSFf-F、pBSjHSFf-M、pBSjHSFf-E以及含可变剪切片段的pBSjHSFs-F、 pBSjHSFs-N、pBSjHSFs-E,酶切及测序鉴定正确；2、序列分析呈示Sj-hsf具有三种剪切亚型Sj-hsf-isoform1 (2050bp)、 Sj-hsf-isoform2(2086bp)、Sj-hsf-isoform3(2111bp), GenBank登陆号分别为KU954546、KX119143、KX119144,均位于日本血吸虫基因组SJC-S000780,有8个外显子,在雌虫、雄虫和虫卵阶段三种亚型均存在,以Sj-hsf-isoform1表达量高；3、Sj-HSF-isoforml (671aa)、Sj-HSF-isoform2(683aa)具有HSF特征性DBD(DNA Binding Domain)、HR-A/B和HR-C结构域,Sj-HSF-isoform3(282aa)提前终止,无HR-C结构域；4、进化树分析表明Sj-HSF三种剪切亚型隶属HSF1家族,与曼氏血吸虫HSF近源。结论1、日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵阶段均存在三种剪切亚型的HSF,以Sj-HSF-isoforml表达量高。2、Sj-HSF三种剪切亚型隶属HSF1家族,具有结构上的差异。
【关键词】：日本血吸虫 热休克蛋白 致弱尾蚴 表达谱 热休克因子 可变剪切
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R532.21
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-15
• 第一章 日本血吸虫热休克蛋白及其在正常尾蚴和致弱尾蚴的表达差异15-36
• 1 材料15-17
• 2 方法17-23
• 3 结果23-32
• 4 讨论32-36
• 第二章 日本血吸虫热休克因子基因结构特征及其可变剪切亚型分析研究36-55
• 1 材料36-37
• 2 方法37-44
• 3 结果44-53
• 4 讨论53-55
• 结语及展望55-56
• 参考文献56-61
• 附录61-71
• 硕士期间成果71-72
• 致谢72-73

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