阿萨希毛孢子菌抗氧化酶活性研究

发布时间：2017-09-02 11:06

  本文关键词：阿萨希毛孢子菌抗氧化酶活性研究

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【摘要】：研究背景细胞在进行有氧呼吸代谢和能量生成的同时,也伴随着细胞内活性氧介质(reactive oxygen species,ROS)的生成[1]。ROS主要包括超氧阴离子(O2·ˉ),过氧化氢(H2O2),羟基自由基(·OH)等,ROS的杀伤力非常强,不仅可以通过破坏核酸、氧化蛋白质、引起脂质过氧化影响多种细胞功能,而且ROS导致的氧化损伤正逐渐成为突变形成、细胞退化、老龄化和凋亡的重要因素[1]。大量病原微生物(如细菌、真菌)的研究表明:在感染宿主过程中,ROS主要来源于微粒体新陈代谢和由吞噬细胞产生的作为杀灭病原体过程的呼吸爆发[1]。此外,多项抗菌药物,尤其是抗真菌药物的研究也证实:唑类、多烯类、棘白霉素类药物也可诱导细胞内ROS的生成[2]。为了生存,病原体进化了很多方式以清除或者修复氧化应激所带来的有害损伤,同时也为其侵袭性感染与致病创造条件。研究表明:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)是保护真菌免受ROS氧化杀伤的两种最主要的抗氧化酶,SOD主要催化O2·ˉ生成H2O2和O2;而CAT可催化H2O2生成H2O2和O2,同时减少·OH的产生,从而降低ROS的氧化损伤[3]。这在白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans,C.neoformans)等常见致病真菌的研究中均已得到证实[4-9]。此外,还有学者发现:CAT和SOD是构成C.albicans毒力的必要因素[4,5]。近年来,由于T.asahii引起的播散性毛孢子菌病的发病率呈明显上升趋势,占深部真菌感染患者的5%~10%[10],并且T.asahii对绝大多数抗真菌药均耐药,一旦该菌在机体造成播散性、系统性感染,死亡率可高达80%以上[11],这使得对T.asahii临床感染的管理与防治变得更加棘手,因此,从抗氧化防御角度探索其感染与致病机制,对T.asahii感染的防治具有重要意义。在前期的研究中,本课题组宗丽娜等人[12]发现:三种不同的氧化剂(甲萘醌、H2O2、二酰胺)可对T.asahii产生不同程度的氧化杀伤作用。因次,我们推测:与其他真菌病原体一样,T.asahii也应该具有相应的抗氧化防御系统,使T.asahii能够入侵宿主体内并造成严重感染而致病。为了验证这一假设,本课题收集笔者所在实验室现有的44株不同来源的T.asahii,测定其SOD和CAT酶活性并进行比较和分析,初步探索其抗氧化防御机制,为进一步研究该菌的感染与致病机制奠定基础。研究目的1.观察和比较T.asahii环境分离菌株和与临床分离菌株抗氧化酶活性;2.观察小鼠体内传代对T.asahii菌株抗氧化酶活性的影响。3.观察氟康唑耐药诱导对T.asahii菌株抗氧化酶活性的影响。研究方法.1.收集44株不同来源T.asahii菌株,将其分为环境组、临床组、体内传代组和体外耐药组四组;取上述菌株新鲜单菌落接种于PDA培养基上35℃生长48h;配置浓度为1.5×108cfu/ml的0.9%无菌生理盐水和T.asahii的悬液;取1ml菌悬液添加到50ml SDB培养基中,震荡培养48h(37℃,150r/min);离心机分离,取下层细胞沉淀用玻璃珠溶解法溶解;强振荡后再次离心机分离,取上层清液用于酶活性的测定。2.用总超氧化物歧化酶测试盒和过氧化氢酶测定试剂盒分别测定过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性,具体操作方法按照说明书执行。BCA法测定蛋白质浓度:用标准血清蛋白作对照。重复3遍。3.SPSS 13.0统计软件分析数据。结果1.环境组:菌株CBS8904、CBS7137、CBS8520 SOD酶活性分别为3.828、3.46、4.75U/mgprot,均值为4.01±0.66U/mgprot,CAT酶活性分别为45.833、42.61、57.082U/mgprot,均值为48.51±7.60U/mgprot。2.临床组:不同临床分离来源菌株抗氧化酶活性不同,SOD酶活性变化范围为6.221~16.826U/mgprot,均值为10.45±3.87U/mgprot,CAT酶活性变化范围为61.956~164.552U/mgprot,均值为110.56±35.77U/mgprot。3.体内传代组:小鼠体内传代第1~5代后,菌株CBS2479、CBS8904、CBS7137和CBS8520的抗氧化酶活性均逐渐升高。临床标准株CBS2479传代前和传5代后的SOD酶活性分别为:6.221 U/mgprot和14.610 U/mgprot(P0.05);其CAT酶的活性分别为61.956 U/mgprot和89.045 U/mgprot(P0.05)。环境株CBS8904传代前和传5代后的SOD酶活性分别为:3.828 U/mgprot和7.854U/mgprot(P0.05);其CAT酶的活性分别为45.833 U/mgprot和61.418U/mgprot(P0.05)。环境株CBS7137传代前和传5代后的SOD酶活性分别为:3.460U/mgprot和5.016 U/mgprot(P0.05);其CAT酶的活性分别为42.610U/mgprot和66.025 U/mgprot(P0.05)。环境株CBS8520传代前和传5代后的SOD酶活性分别为:4.750U/mgprot和7.115 U/mgprot(P0.05);其CAT酶的活性分别为57.082U/mgprot和68.964 U/mgprot(P0.05)。4.体外耐药组:氟康唑耐药诱导后,菌株CBS2479和CBS8904抗氧化酶活性随诱导代数的递增而逐渐升高。临床标准株CBS2479诱导前和诱导10代后的SOD酶活性分别为:6.221 U/mgprot和9.126 U/mgprot(P0.05);其CAT酶的活性分别为61.956 U/mgprot和86.738 U/mgprot(P0.05)。环境株CBS8904诱导前和诱导10代后的SOD酶活性分别为:3.838 U/mgprot和6.921 U/mgprot(P0.05);其CAT酶的活性分别为45.833 U/mgprot和74.128 U/mgprot(P0.05)。而在回复末期,菌株CBS2479和CBS8904抗氧化酶SOD和CAT活性逐渐恢复至正常水平。结论1.T.asahii临床组菌株SOD和CAT酶活性显著高于环境组。体内传代组菌株的抗氧化酶活性随传代次数的递增而逐渐升高;至传代末期第5代菌株SOD和CAT酶活性显著高于传代前;且其CAT酶活性也明显高于环境组。耐药组菌株抗氧化酶活性随诱导代数的递增而逐渐升高;至诱导末期第10代菌株SOD和CAT酶活性显著高于诱导前;且其SOD和CAT酶活性均明显高于环境组。2.不同来源T.asahii抗氧化能力不同,主要体现在抗氧化酶活性的不同,其中,临床组菌株抗氧化能力最强;体内传代组菌株和耐药组菌株次之;环境组菌株最低。
【关键词】：过氧化氢酶 超氧化物歧化酶 阿萨希毛孢子菌
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R756
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 常用缩写词中英文对照表12-14
• 前言14-16
• 技术路线16-17
• 1 材料与方法17-24
• 1.1 材料17-22
• 1.2 方法22-23
• 1.3 统计学分析23-24
• 2 结果24-29
• 2.1 T.asahii环境组与临床组抗氧化酶活性结果24-25
• 2.2 T.asahii体内传代组抗氧化酶活性结果25-26
• 2.3 T.asahii耐药组组抗氧化酶活性结果26-29
• 3 讨论29-32
• 4 结论32-33
• 参考文献33-36
• 综述36-42
• 参考文献39-42
• 在学期间发表的学术论文与研究成果42-44
• 致谢44-45
• 个人简历45

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1 ;提高宿主}D~T黄嘌呤氧化酶活性对流行性乙型脑炎病毒感染性的影响[J];浙医学报;1965年03期

2 赵习Y，

本文编号：778162