慢性HBV感染患者外周血单个核细胞中FoxP3和RORγt mRNA的表达及意义

发布时间：2017-09-12 20:08

  本文关键词：慢性HBV感染患者外周血单个核细胞中FoxP3和RORγt mRNA的表达及意义

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【摘要】：目的:研究调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg细胞)、辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17细胞)的转录因子叉头/翼状螺旋转录因子(Forkhead box protein P3,FoxP3)、孤独核儿受体γt(Orphan nuclear receptorγt,RORγt)mRNA在慢性HBV感染不同阶段患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中的表达水平,分析其与肝功能丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate amino transferase,AST)、总胆红素(Total bilirubin,TBIL)、HBsAg、HBeAg、HBV DNA的关系,并探讨Treg、Th17细胞在慢性HBV感染免疫耐受期可能发挥的作用,以期用外周血指标来判断免疫耐受状态及变化,并指导临床通过免疫治疗打破免疫耐受,对HBV感染进行早期有效治疗。方法:收集天津市第二人民医院2014年4月至2015年3月门诊或住院未经过抗HBV治疗的慢性HBV感染者83例,包括免疫耐受期24例,免疫清除期24例,非活动或低(非)复制期35例,应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测PBMC中FoxP3mRNA、RORγt mRNA的Ct值,用2-DDCt方法计算其相对表达量。同时采用全自动生化分析仪检测受检者ALT、AST、TBIL,应用电化学发光法检测HBV血清学标志物HBsAg、HBeAg、HBeAb,应用实时定量PCR进行病毒HBV DNA定量。以健康人14例作为对照组,比较FoxP3 mRNA、RORγt mRNA在各组中的相对表达量,及其与肝功能、病毒学指标的相关性,探究其在免疫耐受期慢性HBV感染中的作用机制。另对83例研究对象中进行肝组织活检病理检查的慢性HBV感染患者27例进行肝细胞炎症与纤维化程度分析,分析肝组织炎症和纤维化程度与FoxP3、RORγt mRNA相对表达量的关系。结果:1.各期HBV感染者及健康对照组之间FoxP3mRNA相对表达量差异具有统计学意义(P0.05)。免疫耐受期、免疫清除期及非活动或低(非)复制期患者均高于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05),免疫耐受期FoxP3 mRNA相对表达量高于免疫清除期与非活动或低(非)复制期组患者(0.252±0.410vs 0.195±0.381,0.206±0.498),差异有统计学意义(p0.05)。免疫清除期与非活动或低(非)复制期组患者差异无统计学意义(p=0.737)。2.免疫清除期rorγtmrna相对表达量高于健康对照组、免疫耐受期组、非活动或低(非)复制期组(0.421±0.877vs0.102±0.485,0.222±0.743,0.230±0.391),差异均有统计学意义(p0.01)。免疫耐受期、非活动或低(非)复制期组rorγtmrna相对表达量均高于健康对照组(0.222±0.743,0.230±0.391vs0.102±0.485),差异均有统计学意义(p0.05),免疫耐受期、非活动或低(非)复制期组两组间差异无统计学意义(p=0.831)。3.foxp3mrna相对表达量与alt、ast、tbil水平均无明显相关性,与hbvdna显著正相关(p0.05)。rorγtmrna相对表达量与alt、ast均显著正相关(p0.01),与tbil、hbvdna水平均无明显相关性。foxp3mrna的相对表达量与rorγtmrna成显著正相关(r=0.728,p0.001)。4.83例研究对象中hbvdna阳性组foxp3mrna相对表达量高于dna阴性组(0.271±0.341vs0.208±0.669),差异有统计学意义(p0.05)。hbvdna阳性组rorγtmrna相对表达量高于dna阴性组(0.409±0.693vs0.362±0.406),差异无统计学意义。5.83例慢性hbv感染患者中hbeag阳性组foxp3mrna相对表达量低于hbeag阴性组(0.165±0.328vs0.232±0.507),差异无统计学意义(p=0.884)。hbeag阳性组rorγtmrna的相对表达量高于hbeag阴性组(0.361±0.823vs0.240±0.398),差异有统计学意义(p0.05)。6.对83例研究对象中进行肝组织活检病理检查的27例患者进行分析,其中包括免疫耐受期患者2例(病理诊断分别为g1s1-2,g1-2s1)患者肝组织轻度炎症损伤与轻度纤维化;免疫清除期患者14例(病理诊断2例为活动性肝硬化,炎症分级g1有3例,g≥2级有9例,纤维化程度分期,s1及以下有8例,s≥2有4例);非活动期患者11例(炎症程度分级g1有8例,g2有3例,纤维化程度分期s1及s2以下9例,s≥2的2例)。7.27例进行肝组织病理检查的患者中肝脏炎症程度为g≥2的患者(14例)pbmc中foxp3mrna的相对表达量高于g1组(13例)(0.162±0.280vs0.044±0.066),差异有统计学意义(p0.05),g≥2组rorγtmrna的相对表量高于g1组(0.489±1.135vs0.073±0.062),差异有统计学意义(p0.05);肝脏纤维化程度为s1的患者(11例)pbmc中rorγtmrna的相对表达量高于s1组(16例)(0.589±1.273vs 0.083±0.076),差异有统计学意义(P0.05),S1组FoxP3 mRNA的相对表达量与S1组差异无统计学意义(P0.05)。结论:1.免疫耐受期HBV感染者存在Treg/Th17细胞失衡,监测其转录因子FoxP3mRNA、RORγtmRNA表达情况,能够有助于评估机体细胞免疫状态,可能为抗病毒治疗时机选择提供参考。2.Treg细胞在免疫耐受期占优势,可能为导致免疫耐受机体免疫状态的原因之一。Th17细胞在免疫清除期占优势,Th17细胞具有促进炎症反应作用,利于病毒的清除。3.FoxP3mRNA与HBV DNA载量正相关,抑制免疫反应,HBV DNA高载量复制。RORγtmRNA促进炎症反应,HBeAg发生血清学转换后,炎症反应恢复正常,RORγtmRNA表达量下降4.RORγtmRNA在肝细胞纤维化进程中可能发挥着重要的作用,有助于判断纤维化程度或是评估肝细胞是否存在纤维化。5.除了常规检测慢性HBV感染者肝功能及病毒学指标外,动态监测慢性HBV感染者体内Treg、Th17细胞数及其相关转录因子,可以了解患者机体的免疫状态及变化,可能为抗HBV的治疗时机选择提供参考意义。
【关键词】：HBV 感染 免疫耐受 Treg 细胞 Th17 细胞 FoxP3 RORγt
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 缩略语/符号说明13-15
• 前言15-21
• 研究现状、成果15-20
• 研究目的、方法20-21
• 1.材料21-24
• 1.1 研究对象21-22
• 1.2 主要试剂22-23
• 1.3 主要仪器与耗材23-24
• 2．方法24-28
• 2.1 标本采集24
• 2.2 实验步骤方法24-27
• 2.2.1 外周血单个核细胞提取24-25
• 2.2.2 细胞内RNA提取及逆转录25-26
• 2.2.3 实时荧光定量PCR26-27
• 2.3 其他临床指标的检测27-28
• 2.3.1 生化学指标检测27
• 2.3.2 血清HBV标志物检测27-28
• 2.3.3 血清 HBV DNA 水平检测28
• 2.3.4 肝脏组织病理学检测28
• 2.4 数据处理和统计学分析28
• 3．结果28-32
• 3.1 各组受检者人口学数据资料及临床指标检测情况28-29
• 3.2 各组患者的外周血单个核细胞中FoxP3 mRNA表达情况29
• 3.3 各组患者的外周血单个核细胞中RORγt mRNA表达情况29-30
• 3.4 FoxP3 mRNA、RORγt mRNA与肝功能、HBV DNA等指标的相关性分析30
• 3.5 FoxP3 mRNA、RORγt mRNA在HBV DNA阳性组与DNA阴性组的相对表达量30
• 3.6 FoxP3 mRNA、RORγt mRNA在HBeAg阳性组与HBeAg阴性组的相对表达量30-31
• 3.7 肝组织病理检测结果31
• 3.8 肝组织不同炎症程度及纤维化分期患者FoxP3 mRNA、RORγt mRMA表情况31-32
• 4.讨论32-42
• 结论42-43
• 参考文献43-47
• 发表论文和参加科研情况说明47-48
• 附录48-50
• 综述 FoxP3、RORγt细胞因子与慢性HBV感染50-60
• 综述参考文献57-60
• 致谢60

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本文编号：839263