小鼠脑微血管内皮细胞与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析

发布时间：2017-09-15 23:12

  本文关键词：小鼠脑微血管内皮细胞与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析

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【摘要】：研究背景全球每年有高达100万隐球菌性脑膜脑炎(简称隐脑)新发病例,每年有接近62万人死于本病,隐球菌病日益受到人们的重视。隐球菌区别于其他重要医学真菌的特征是具有多糖荚膜,传统认为其胞外多糖组分分为三种：葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan,GXM)、半乳糖木糖甘露聚糖(galactoxylomannan, GalXM)和甘露糖蛋白(mannoprotein,MP)。近年来,应用血清学技术、磁共振技术和糖组分分析,对隐球菌荚膜的了解逐步加深,不同菌株间GXM的差异致使抗原性的不同,目前基于此新生隐球菌划分为5种血清型——A、B、C、D和AD型。GXM是隐球菌荚膜多糖最主要的成分,约占荚膜总质量的88%。一般认为荚膜多糖的毒性作用主要表现在保护菌体抗吞噬作用和影响宿主免疫防御两方面。虽然体外实验有较为充分的证据,但对于溶解的多糖和细胞附属的多糖哪个更具毒性等问题并不清楚。隐球菌病的突出特点在于具有强烈的嗜中枢性,其中九成以上播散性隐球菌感染侵犯中枢神经系统,但这一特征的分子机制目前仍不清楚。一直以来,隐球菌如何通过血-脑脊液屏障的分子机制都是研究者们关注的热点和研究的难点。脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞三者共同组成血-脑脊液屏障,组成的紧密连接网状结构,能够有效隔离开血液和脑脊液,严格调控两者间物质交换。其中,脑微血管内皮细胞是维持血-脑脊液屏障功能最重要的细胞；与周围组织内皮细胞间不同点在于,脑微血管内皮细胞具极低胞吞能力、表达特异肽转运蛋白和离子,毗邻的脑微血管内皮细胞间形成丰富的紧密连接,形成有效的物理屏障,显著降低了小分子物质的通透。有学者发现隐球菌菌体与脑微血管内皮细胞相互作用,能够引起脑微血管内皮细胞功能改变,可能与隐球菌穿透血脑屏障相关。本研究就荚膜最主要成分GXM对脑微血管内皮细胞的影响进行初步的探索。研究目的探索新生隐球菌GXM能否影响脑微血管内皮细胞基因的表达,为进一步挖掘隐球菌嗜中枢性的分子机制提供线索、奠定基础。研究方法第一部分使用Roche NimbleGen 12 x 135K小鼠基因表达谱芯片筛选小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3与不同浓度新生隐球菌GXM作用后差异表达的基因；结合基因本体论(GO,Gene Ontology),使用标准富集法对差异表达的基因进行GO分析,进行GO项top10排序,推断所筛选差异基因的功能；结合GO语义,筛选与隐球菌侵袭中枢神经系统能力相关的差异表达基因的信息。第二部分对筛选出的重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1,采用荧光实时定量PCR对其变化加以验证。结果第一部分我们对bEnd.3细胞与新生隐球菌GXM作用前后基因表达进行对比发现,实验组(GXM (90μg/ml)组总共有402个基因表达上调,296个基因表达下调,GXM (180μg/ml)组总共有421个基因表达上调,564个基因表达下调。GO项目top10排序提示,新生隐球菌GXM能够调节脑微血管内皮细胞基因表达,细胞紧密连接、信号转导、细胞骨架、细胞膜成分相关代谢等GO条目变化显著。第二部分PIK3C2G基因和ADAMDECl基因进行荧光定量PCR验证,结果与芯片结果一致,基因表达水平不同程度上升,且与GXM浓度正相关。结论新生隐球菌GXM可以影响脑微血管内皮细胞基因的表达,PIK3C2G基因、ADAMDECl基因表达水平上调可能和隐球菌侵袭血脑屏障能力有关。
【关键词】：脑微血管内皮细胞 新生隐球菌 GXM 基因芯片
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R519.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 缩略词表9-10
• 前言10-14
• 第一部分 小鼠脑微血管内皮细胞系BEND.3与新生隐球菌GXM作用后基因表达谱分析14-49
• 一、主要材料和设备14-16
• 二、实验方法与步骤16-24
• 三、实验结果24-47
• 四、讨论47-49
• 第二部分 小鼠脑微血管内皮细胞系BEND.3与新生隐球菌GXM作用后PIK3C2G基因与ADAMDEC1基因表达水平的改变49-60
• 一、主要材料和设备49-51
• 二、实验方法与步骤51-54
• 三、实验结果54-58
• 四、讨论58-60
• 论文小结60-61
• References61-64
• 综述：隐球菌病免疫治疗的研究进展64-71
• References68-71
• 在读期间参加科研工作及学术会议情况71-72
• 致谢72

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