基于qRT-PCR建立评价Ⅱ型登革病毒抗体中和效应的微量中和试验方法

发布时间：2017-09-17 23:04

  本文关键词：基于qRT-PCR建立评价Ⅱ型登革病毒抗体中和效应的微量中和试验方法

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【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)是热带与亚热带地区发病最多、危害最大的虫媒病毒,DENV感染一般可引起登革热(Dengue fever,DF),严重的还能引起登革出血热(dengue haemorrhagic fever,DHF)、甚至是死亡率极高的登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。目前正在研制中的DENV疫苗种类较多,但仅有赛诺菲公司生产的四价疫苗于2015年12月才在墨西哥获得批准。如何准确、高效地测定和评价疫苗刺激产生的抗体的中和效应一直是DENV疫苗研制的难题之一。传统的测定中和抗体效价的方法是中和试验(Neutralization Test,NT),其中空斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test,PRNT)一直被誉为“金标准”,但其操作繁琐、耗时长、通量低。而微量中和试验(Micro-neutralization Test,MN)的基本原理与PRNT相同,优点在于试剂用量少、通量高。目前基于Taq Man探针的实时定量PCR(q RT-PCR)具有高特异性、高敏感性和易于高通量检测等诸多优势,已被广泛用于病毒核酸的定量检测。近年来,多项研究表明基于q RT-PCR建立的MN方法可有效地应用于测定病毒中和抗体效价,譬如在流感病毒、CMV和SV40的中和抗体效价测定方面已经成功建立了q RT-PCR-MN方法。本研究以DENV2为研究对象,首先建立了基于一步法Taq Man探针q RT-PCR检测DENV2 RNA的方法并进行优化,然后在此基础上建立了测定DENV2中和抗体效价的q RT-PCR-MN方法,并进行了一系列条件优化。【研究方法及结果】一、一步法Taq Man探针q RT-PCR检测DENV2 RNA的建立及优化首先培养DENV2的易感细胞C6/36,按MOI=0.1接种细胞进行病毒大量增殖,获得的病毒经浓缩后保存于-80℃备用。然后分别用空斑实验、TCID50检测、免疫荧光实验对DENV2毒力进行测定,病毒滴度分别为2×106 PFU/m L、2.53×105TCID50/m L。针对DENV2保守区域NS5基因,分别设计并合成引物和探针,PCR扩增得到目的片段并制备RNA标准品,经核酸电泳验证均与预期大小一致。将标准品10倍系列稀释作为模板,进行一步法Taq Man探针q RT-PCR,绘制标准曲线,并进一步探索PCR反应体系中引物与探针的最佳配比。结果显示,q RT-PCR方法检测DENV2 RNA的线性范围为1.0×102~108 copies/μl。与空斑实验结果进行比较,1PFU对应大约7500 copies。计算出q RT-PCR方法检测DENV2的灵敏度为0.013PFU,大约是空斑实验的75倍。二、检测DENV2抗体中和效应的q RT-PCR-MN方法的建立在上述实验的基础上,通过q RT-PCR方法测定系列稀释病毒感染BHK-21细胞后上清中的病毒量随时间的动态变化,确定最佳感染剂量为2000 TCID50和最佳检测时间为感染后24小时。然后两倍系列稀释病毒感染BHK-21细胞24小时后,q RT-PCR方法同时检测细胞上清(未提取RNA)和细胞内(提取RNA)的病毒量,结果发现细胞内外病毒量呈正相关,相关系数r=0.998,而且感染细胞上清中病毒量与感染剂量呈正相关,r=0.982。以上结果证明了直接以感染细胞上清作为PCR检测样品的可行性,q RT-PCR方法可以至少辨别两倍病毒感染剂量的变化。在此基础上,建立了测定DENV2中和抗体效价的q RT-PCR-MN方法。以35份血清为研究对象时,分别用PRNT和q RT-PCR-MN方法测定抗体的中和效应,两者相关系数r=0.928;再以抗DENV2的单克隆抗体4G2为研究对象时,结果显示PRNT(IC50)为0.17μg/m L,q RT-PCR-MN(IC50)为0.10μg/m L,两者相关系数r=0.944。以PRNT为对照,分析35份血清的检测结果,q RT-PCR-MN的灵敏度为100%(7/7,95%CI:0.59 1.00),特异性为96.43%(27/28,95%CI:0.82 1.00),Kappa系数为0.915,说明一致性较好。最后,我们在三台不同品牌实时定量PCR仪上用q RT-PCR-MN方法同时检测10份血清的中和效价,结果无统计学差异,这说明建立的q RT-PCR-MN方法在不同仪器上具有较好的可比性,有利于各实验室之间结果的互认。【结论】本研究成功建立了以q RT-PCR为基础的测定DENV2中和抗体效价的微量中和试验方法。以经典PRNT为参照,该方法灵敏度、特异性、一致性评价均较好。本方法中以上清液直接作为PCR检测样品,简便快捷,而且便于自动化检测。不同仪器之间的检测结果具有较好的可比性,有利于在临床实验室推广。本研究不仅适用于快速有效地检测和评价DENV疫苗刺激产生的中和抗体效价,也适用于DENV爆发流行时的大规模流行病学调查研究。
【关键词】：登革病毒 微量中和试验 qRT-PCR
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.8;R446.6
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-30
• 第一部分 一步法TaqMan探针qRT-PCR检测DENV2方法的建立及优化30-46
• 1 材料30-33
• 1.1 毒种和细胞株30
• 1.2 主要试剂30-31
• 1.3 常用培养液（基）与缓冲液31-32
• 1.4 主要仪器与器材32-33
• 2 方法33-40
• 2.1 细胞培养33
• 2.2 病毒的增殖与毒力检测33-35
• 2.3 引物设计与合成35-36
• 2.4 标准品的制备36-38
• 2.5 标准曲线38-40
• 3 结果40-44
• 3.1 浓缩DENV2毒力检测40-41
• 3.2 DENV2 NS5基因片段的PCR扩增41-44
• 4 讨论44-46
• 第二部分 检测DENV2抗体中和效应的qRT-PCR-MN方法的建立46-59
• 1 材料46-47
• 1.1 毒种和细胞株46
• 1.2 主要试剂与抗体46
• 1.3 常用培养液（基）与缓冲液46-47
• 1.4 主要仪器与器材47
• 2 方法47-50
• 2.1 引物、探针设计与合成47
• 2.2 空斑减少中和试验47-48
• 2.3 qRT-PCR-MN测定48-49
• 2.4 提取DENV2感染细胞内总RNA49-50
• 2.5 不同的实时定量PCR仪比对50
• 3 结果50-56
• 3.1 最佳病毒感染剂量和感染后检测时间的确定50-51
• 3.2 感染后细胞内外病毒量的相关性51
• 3.3 qRT-PCR方法可以辨别病毒感染剂量两倍的变化51-52
• 3.4 PRNT与qRT-PCR-MN相关性分析52-54
• 3.5 qRT-PCR-MN方法的特异性、灵敏度和一致性分析结果54-55
• 3.6 qRT-PCR-MN方法在不同实时定量PCR仪上一致性的分析55-56
• 4 讨论56-59
• 小结59-60
• 参考文献60-73
• 个人简历和研究成果73-74
• 致谢74-75

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