伯氏疏螺旋体重组膜蛋白A对人白血病T淋巴细胞株的体外作用及对昆明小鼠体内作用的研究

发布时间：2017-09-20 15:23

  本文关键词：伯氏疏螺旋体重组膜蛋白A对人白血病T淋巴细胞株的体外作用及对昆明小鼠体内作用的研究

  更多相关文章： 关节莱姆病 rBmpA 人白血病T淋巴细胞Jurkat 细胞因子 趋化因子

【摘要】：研究目的：1.本实验以人白血病T淋巴细胞株Jurkat细胞为模型,利用蛋白芯片技术、酶联免疫吸附试验(Enzymes linked immunosorbent assay,Elisa)及实时定量RT-PCR技术,研究伯氏疏螺旋体重组膜蛋白A (recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激Jurkat细胞产生细胞因子及刺激昆明小鼠关节产生趋化因子的作用,以探索rBmpA与莱姆关节炎发病的关系。2.以人白血病T淋巴细胞株Jurkat细胞为模型,用ELISA方法检测经rBmpA刺激后Jurkat细胞培养上清液中细胞因子：白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A (IL-17A)及肿瘤坏死因子TNF-a,从细胞水平探讨rBmpA致莱姆关节炎的作用机制。3.以伯氏疏螺旋体重组膜蛋白A (recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激昆明小鼠关节造模,参照高通量抗体蛋白芯片筛选结果,采用RT-PCR方法检测经rBmpA刺激后小鼠关节及血中趋化因子：(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)的表达水平,从基因水平探讨rBmpA致莱姆关节炎的作用机制。研究方法：1、24孔细胞培养板培养Jurkat细胞[培养基为5%RPMI-1640培养基,细胞浓度5×105/mL,体积1ml],培养6-12小时后,待细胞适应后,用100μg/mL植物血凝素PHA及80μg/mL rBmpA分别处理Jurkat细胞,在作用12小时、24小时后收集细胞培养上清液。2、用ELISA法检测细胞上清液中细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α)的表达量。3、将昆明小鼠随机分为三组：实验组(0.005mg/ml)、对照组(0.01M PBS)、空白组(不予任何处理),左右腿均50ul,7天、14天分批处理,分别收集小鼠关节液及眼角血液,参照高通量抗体蛋白芯片筛选结果,采用RT-PCR法分别检测关节液及眼部血液中趋化因子(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)基因mRNA的表达水平。4、设计特异性引物扩增目的基因(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1α/CXCL12)和内参基因(GAPDH),将RNA反转录为cDNA,运用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测趋化因子(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)mRNA转录水平,利用计算相对表达量法进行相对定量分析,应用统计软件对其进行统计学分析。研究结果：1、本次研究成功探索出人白血病T淋巴细胞株(jurkat细胞)体外培养条件、方法及注意事项。2、本次研究用rBmpA刺激昆明小鼠关节造模,成功建立了小鼠莱姆关节炎模型。3、ELISA结果显示：80 μ g/mL的rBmpA和100 μ g/mL的PHA都可以诱导人白血病T淋巴细胞株(jurkat细胞)活化分泌释放细胞因子IL-4和IL-17A,差异有统计学意义。4、用ELISA法分别检测rBmpA刺激小鼠莱姆关节炎的动物模型试验的小鼠血清上清液及关节匀浆液的IL-17含量,结果表明：实验组(rBmpA组)IL-17含量明显高于对照组(PBS组)和空白组,差异有统计学意义,p0.05。5、通过蛋白芯片技术对25种小鼠趋化因子进行检测,成功筛选出CCL3和CXCL16两个趋化因子做后续的研究。6、小鼠血清上清液和关节匀浆液趋化因子CCL3 mRNA实时荧光定量PCR检测结果均表明：7d后和14d后,实验组(rBmpA组),对照组(PBS组),空白组三组之间CCL3基因mRNA相对表达量之间存在差异,rBmpA组CCL3基因mRNA相对表达量均高于实验组和对照组,差异均有统计学意义(p0.05)。7、小鼠关节匀浆液趋化因子CXCL16 mRNA实时荧光定量PCR检测结果也表明,实验组(rBmpA组),对照组(PBS组),空白组三组之间CXCL16基因mRNA相对表达量之间存在差异,rBmpA组CXCL16基因mRNA相对表达量均高于实验组和对照组,差异均有统计学意义(p0.05)。结论：1、本次研究成功探索出人白血病T淋巴细胞株(jurkat细胞)体外培养方法,同时成功建立了小鼠莱姆关节炎动物模型。2、体外研究(rBmpA刺激人类白血病T淋巴细胞株(Jurkat细胞)诱导其活化分泌释放细胞因子IL-4和IL-17A)和体内研究(莱姆关节炎动物模型中rBmpA刺激炎性因子IL-17, CCL3, CXCL16的变化)都证明了：rBmpA与莱姆关节炎的发生机制有关,同时也说明细胞因子、趋化因子与莱姆病关节炎的发生、发展密切相关。
【关键词】：关节莱姆病 rBmpA 人白血病T淋巴细胞Jurkat 细胞因子 趋化因子
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R514
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 相关缩略词12-14
• 引言14-20
• 1.1 莱姆病临床症状及诊断14-15
• 1.2 伯氏疏螺旋体及伯氏疏螺旋体膜蛋白A(BmpA)15-17
• 1.3 莱姆病关节炎致病机理17-19
• 1.4 实验目的及意义19-20
• 第一部分 伯氏疏螺旋体重组膜蛋白A(rBmPA)对人白血病T淋巴细胞株的体外作用20-34
• 1、人白血病T淋巴细胞株(jurkat细胞)体外培养方法20-26
• 1.1 实验材料及主要溶液20-23
• 1.2 实验方法23-24
• 1.3 实验结果24-26
• 2、酶联免疫吸附试验(Elisa)检测rBmpA刺激小人白血病T淋巴细胞株(jurkat细胞)产生细胞因子的影响26-34
• 2.1 材料27-29
• 2.2 实验方法29-30
• 2.3 实验结果30-34
• 第二部分 伯氏疏螺旋体重组膜蛋白A(rBmPA)对昆明小鼠体内作用的研究34-59
• 1、莱姆关节炎动物模型建立34-37
• 1.1 实验动物34
• 1.2 主要仪器34-36
• 1.3 实验溶液配置36
• 1.4 小鼠模型的建立36-37
• 2、莱姆关节炎动物模型中rBmpA刺激白细胞介素-17的变化研究37-42
• 2.1 主要仪器37-38
• 2.2 主要溶液试剂配制38
• 2.3 样本收集38
• 2.4 统计学处理38
• 2.5 实验结果38-42
• 3、rBmpA刺激小鼠莱姆关节炎产生趋化因子的蛋白芯片检测42-48
• 3.1 主要仪器43-45
• 3.2 主要溶液试剂配制45
• 3.3 样本收集45
• 3.4 蛋白芯片技术检测rBmpA刺激小鼠莱姆关节炎产生趋化因子结果45-48
• 4、rBmpA刺激小鼠莱姆关节炎产生趋化因子的实时荧光定量PCR方法检测48-59
• 4.1 主要仪器49-51
• 4.2 主要溶液试剂配制51
• 4.3 样本收集51
• 4.4 实验方法51-52
• 4.5 统计学处理52
• 4.6 实验结果52-59
• 全文讨论59-63
• 参考文献63-71
• 综述71-80
• 参考文献76-80
• 攻读学位期间发表文章情况80-81
• 致谢81

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本文编号：888836