基于高丰度转录本的细菌RT-qPCR检测技术及其应用

发布时间：2017-09-23 07:37

  本文关键词：基于高丰度转录本的细菌RT-qPCR检测技术及其应用

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【摘要】：近些年来,随着结核杆菌病的死灰复燃以及超级细菌的出现,时刻提醒着人们细菌性传染病仍然是人类生命健康的重大威胁。传染病的早期诊断是开展治疗和防控的前提,是预防控制传染病的首要任务。随着科学技术的不断发展,人们发明了各种检测和诊断疫病的方法,如传统的微生物培养法、免疫检测法、分子生物学检测方法等。分子生物学检测方法是现代检测致病微生物的检测核心技术,尤以PCR技术为代表,其具有快速、灵敏、特异性强、且具有多种广泛的应用形式等优点。然而众多PCR衍生技术均是以基因组为检测靶标的方法,这些方法在检测病毒性致病微生物上很灵敏,但在检测细菌性致病微生物时却受到了一定的限制。因细菌基因组拷贝数等于细菌的数量,临床上一些细菌在宿主内的数量有限,尤其是胞内寄生菌,从而限制了分子生物学的检测。因此,提高这类病原的检测具有重要意义。编码基因在表达的时候,会转录出不同丰度的RNA,对于高表达的基因,其转录的m RNA丰度远高于编码基因本身。因此我们假设,如果将高表达的基因以及它转录出的m RNA作为检测的靶标,就有可能大大提高细菌检测的灵敏性。而根据逆转录PCR的原理,它有可能满足同时对DNA和RNA进行扩增的要求。且逆转录PCR已经在病毒性微生物的检测中以及活菌的检测中得到普遍应用,但在细菌性致病微生物的检测中尚未见到报道。本实验以马耳他布鲁氏菌16M为模型菌,提取16M的RNA进行转录组测序寻找高表达基因,并将此基因与它转录生成的m RNA作为检测靶标,利用实时荧光定量逆转录PCR的方法,实现对细菌性致病微生物快速灵敏的检测。为了比较基于转录本检测的实时荧光定量逆转录PCR方法的可行性,我们比较了RT-q PCR和q PCR对DNA和RNA的扩增效率,结果发现:RT-q PCR方法既可以对DNA进行有效扩增又可以对RNA进行有效扩增,而q PCR方法只能对DNA进行有效扩增。然而,在比较RT-q PCR对DNA和RNA的扩增效率时,我们发现RT-q PCR对RNA扩增的CT值远远大于对DNA扩增的CT值,这与理论不符。为此我们比较了RNA的浓度用DNA酶处理前后的变化。结果发现用Trziol裂解法所提取的RNA中存在着严重的DNA的污染,且该方法所提取的RNA效率低,只有22.7%是RNA分子,不足以用于RT-q PCR方法的检验。为了提高RT-q PCR的检测效率,我们用一种简单的热变性方法处理样本,得到总核酸,再分别进行RT-q PCR和q PCR实验,结果发现,RT-q PCR实验检测总核酸的CT值比q PCR检测总核酸的CT值小5个数值,说明该种方法可以避免RNA损失,提高了RT-q PCR方法的检测效率。为了进一步比较应用热变性处理样品后RT-q PCR方法和q PCR方法检测的灵敏性,我们将16M总核酸进行10倍梯度稀释,结果表明,对于每一个梯度稀释的总核酸,RT-q PCR方法检测的CT值都要比q RCR方法检测的CT值小5个数值,且RT-q PCR方法的检测下限低于q PCR方法的检测下限。为了找到合适的靶基因对16M进行检测,我们对其他的候选基因进行比较分析,结果表明,基因BMEI1305的检测效果最佳,可作为应用RT-q PCR方法检测马耳他布鲁氏杆菌16M的靶标。为了评价RT-q PCR检测方法在临床样本上的敏感性,我们对10名血清学检测为阳性的布病患者的血液进行了比较评价,发现在这10份样品中,应用q PCR方法检测出4份样品为阳性;应用RT-q PCR方法检测出6份样品为阳性。这些数据表明,在布病的诊断中,RT-q PCR的检测灵敏性和准确性高于q PCR的检测方法,可以减少假阴性率的发生。为了评价该方法是否具有通用性,我们在五种致病性细菌上较了q PCR和RT-q PCR的检测效率。结果发现,在这五种细菌中RT-q PCR的检测方法比q PCR的检测方法都灵敏。表明RT-q PCR可以作为一种通用的检测方法。综上,以转录本为基础的RT-q PCR检测方法在对细菌性致病微生物的检测上具有灵敏性高,特异性好,且具有通用性等特点,可以为作为辅助临床诊断的检测方法。
【关键词】：转录本 细菌 检测 逆转录荧光定量PCR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R52;R440
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写词表11-12
• 引言12-14
• 第一篇 文献综述14-25
• 第1章 传染性疾病的流行现状14-17
• 第2章 细菌检测方法的研究现状17-25
• 2.1 传统的细菌检测方法17-18
• 2.2 免疫学检测方法18-20
• 2.3 分子生物学检测方法20-25
• 第二篇 研究内容25-54
• 第1章 基于转录本检测技术原理的阐述25-27
• 第2章 靶标基因的筛选及RT-qPCR扩增效率的验证27-40
• 2.1 实验材料27-28
• 2.2 实验方法28-33
• 2.3 实验结果33-37
• 2.4 讨论37-40
• 第3章 基于转录本检测技术原理的验证40-49
• 3.1 实验材料40
• 3.2 实验方法40-43
• 3.3 实验结果43-47
• 3.4 讨论47-49
• 第4章 基于转录本检测方法的通用性验证49-54
• 4.1 材料49
• 4.2 方法49-52
• 4.3 实验结果52-53
• 4.4 讨论53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-61
• 附录61-65
• 导师简介65-67
• 作者简介67-68
• 攻读硕士期间发表的学术论文68-69
• 致谢69

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本文编号：904028