乙型肝炎病毒X蛋白通过CDC42蛋白诱发Huh7细胞恶性转化的机制研究

发布时间：2017-09-25 22:39

  本文关键词：乙型肝炎病毒X蛋白通过CDC42蛋白诱发Huh7细胞恶性转化的机制研究

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【摘要】：肝细胞癌是世界第五大流行癌症,致死率非常高。慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染被认为是诱发肝癌的主要因素。研究发现HBV基因组x基因编码的X蛋白(hepatitsis B virus X protein, HBx)在HBV复制和诱发肝癌过程中具有重要作用。课题组前期对HBx转基因小鼠SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)定量蛋白质组学研究发现,在HBx诱发小鼠肝脏由重度炎症转变为癌症过程中,CDC42信号通路相关分子及CDC42蛋白本身蛋白表达量上调,提示在HBx诱发小鼠肝癌过程中,CDC42信号通路被激活。激活的CDC42可参与多条信号通路,引起细胞骨架、细胞周期、细胞侵袭转移能力等改变。为了解CDC42蛋白是否参与以及如何参与HBx介导的Huh7细胞恶性转化,本研究首先通过CRISPR/Cas9技术对Huh7-HBx细胞中的CDC42基因进行修饰,而后通过添加CDC42特异性抑制剂CASIN抑制Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞中CDC42活性,探究CDC42功能破坏时HBx介导的Huh7恶性转化程度变化,进而揭示CDC42在HBx诱发人肝细胞恶性转化中的作用。研究结果将为深入理解HBV致癌机制、寻找HBV相关肝癌的治疗靶标提供理论依据。具体研究结果如下：1.HBx介导Huh7细胞恶性转化为了解HBx基因的异常表达是否可引起人肝癌细胞系Huh7细胞系的恶性转化,首先应用实时定量PCR检测Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞中HBx基因表达情况,采用CCK-8试剂盒检测2种细胞的增殖能力、Annex V和FITC试剂盒检测细胞凋亡水平,并通过细胞划痕实验检测HBx基因转染前后Huh7细胞迁移能力的变化情况。结果显示：(1)Huh7-HBx细胞中HBx基因的表达显著高于Huh7-mock细胞(p0.01)；(2)Huh7-HBx细胞的增殖能力显著高于Huh7-mock细胞(p0.01)；(3)Huh7-HBx细胞的抗凋亡能力显著高于Huh7-mock细胞(流式细胞仪分析)。(4)Huh7-HBx细胞的迁移能力高于Huh7-mock细胞；(5)与Huh7-mock细胞相目比,Huh7-HBx细胞中CDC42蛋白表达量升高(Western blot分析)。2.HBx介导Huh7细胞恶性转化依赖CDC42为了验证CDC42蛋白是否参与HBx介导的Huh7细胞恶性转化,首先应用CRISPR/Cas9系统对Huh7-HBx细胞中CDC42基因进行编辑,检测CDC42基因敲除前后细胞的增殖能力、凋亡水平及迁移能力,而后采用CDC42蛋白特异性抑制剂CASIN处理Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞,了解其对细胞增殖及凋亡水平的影响。结果发现：(1)获得在CDC42基因第二外显子处具有4个碱基缺失的突变体细胞(Huh7-HBx CDC42 KO);(2)Huh7-HBx CDC42 KO细胞增殖能力显著低于Huh7-HBx细胞(p0.01)；(3)Huh7-HBx CDC42 KO细胞群体中晚期凋亡细胞比例升高,即细胞抗凋亡能力显著下降；(4)Huh7-HBx CDC42 KO细胞的迁移能力低于Huh7-HBx细胞；(5)不同浓度CASIN处理一定时间后,Huh7-HBx细胞的增殖能力显著降低(p0.01),而Huh7细胞的增殖能力没有显著变化；Huh7-HBx细胞的抗凋亡能力显著下降(pO.01),而Huh7细胞抗凋亡能力在抑制剂处理前后没有显著变化。3.CDC42参与HBx介导Huh7细胞恶性转化的定量蛋白质组研究为了鉴定参与HBx介导Huh7细胞恶性转化的CDC42蛋白下游效应因子,利用基于质量亏损的准等重二甲基标记技术分别对Huh7-mock细胞和Huh7-HBx细胞的全蛋白在肽段水平进行化学标记,混合后的肽段经离线液相分离,Q Exactive HF质谱仪进行质谱检测,pFind3.0搜索引擎处理数据。结果显示：(1)在Huh7-HBx(30L)和Huh7-HBx CDC42 KO (30H)组数据中,共定量到4436个蛋白,其中差异蛋白为523个,上调蛋白为239个,下调蛋白共284个；(2)下调蛋白的功能主要聚集在细胞死亡、细胞凋亡等途径；(3)IQGAP1蛋白作为CDC42的下游效应因子可能参与了HBx介导的Huh7细胞恶性转化。以上研究结果表明,HBx进入Huh7细胞后,通过调控CDC42蛋白活性,使其与IQGAP1结合,导致Huh7细胞的分裂、增殖等生命活动发生紊乱,最终导致了Huh7细胞恶性化程度的升高。本研究结果提示HBx/CDC42/IQGAP1信号通路在HBx诱发肝细胞恶性转化中可能具有重要作用,也许是HBV致癌的一种新机制。
【关键词】：HBx CDC42 IQGAP1 细胞恶性转化 定量蛋白质组学
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62;R735.7
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 中英文缩略词表13-15
• 第一篇 文献综述15-24
• 第一章 乙型肝炎病毒X蛋白在肝细胞癌中的作用研究进展16-20
• 1. HBx与HBV基因组的复制与表达16-17
• 2. HBx与肝细胞癌17
• 3. HBx与细胞凋亡17-19
• 3.1 HBx促进细胞凋亡18
• 3.2 HBx抑制细胞凋亡18-19
• 4. HBx与肝细胞恶性转化19-20
• 第二章 CDC42在癌症中作用的研究进展20-22
• 1. CDC42与细胞侵袭、转移20-21
• 2. CDC42与细胞极性21-22
• 3. CDC42在癌症中的作用22
• 目的及意义22-24
• 第二篇 研究内容24-60
• 第一章 HBx基因介导人肝癌细胞系Huh7细胞恶性转化25-35
• 前言25
• 1. 实验材料与方法25-31
• 1.1 实验材料25-28
• 1.2 实验方法28-31
• 2. 结果与分析31-33
• 2.1 HBx基因在Huh7细胞中的表达水平31
• 2.2 HBx介导Huh7细胞恶性转化31-33
• 3. 讨论33-34
• 4. 小结34-35
• 第二章 HBx介导的Huh7细胞恶性转化依赖CDC42蛋白35-50
• 前言35
• 1. 实验材料与方法35-42
• 1.1 实验材料35-36
• 1.2 实验方法36-42
• 2. 结果与分析42-48
• 2.1 gRNA与CRISPR/Cas9载体连接42
• 2.2 gRNA内源活性检测42-44
• 2.3 单克隆分选与鉴定44
• 2.4 CDC42基因敲除对Huh7-HBx细胞表型的影响44-46
• 2.5 CDC42蛋白活性在HBx介导Huh7恶性转化中的作用46-48
• 3. 讨论48-49
• 4. 小结49-50
• 第三章 CDC42参与HBx介导的肝细胞恶性转化的定量蛋白组学研究50-60
• 前言50
• 1. 实验材料与方法50-54
• 1.1 实验材料50-51
• 1.2 实验方法51-54
• 2. 结果与分析54-58
• 2.1 质谱样品的制备54-55
• 2.2 二甲基化标记效率分析55
• 2.3 定量蛋白质组学数据分析55-56
• 2.4 CDC42下游蛋白IQGAP1蛋白表达下调56-58
• 3. 讨论58-59
• 4. 小结59-60
• 全文总结60-61
• 参考文献61-70
• 附表70-83
• 致谢83-85
• 攻读硕士学位期间发表论文85

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