羊布鲁氏菌UGPase缺失株的构建及菌壳的免疫特性研究

发布时间：2017-10-09 16:38

  本文关键词：羊布鲁氏菌UGPase缺失株的构建及菌壳的免疫特性研究

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【摘要】：布鲁氏菌是一种能感染人和动物的革兰氏阴性杆菌,该菌所引起的布鲁氏菌病(简称布病)广泛流行于世界各地,对人类健康和畜牧业生产造成了严重影响。2000年以后,我国人畜布病流行广泛,危害巨大,已成为严重的公共卫生问题。布病难以防控的主要原因有三个方面:一是其致病与免疫机理不清楚或不完全清楚;二是诊断技术相对落后;三是现有的疫苗毒副作用大,免疫效果差,特别是免疫动物与自然感染的动物不能区别。为此,研究更安全,带有可鉴别的分子标记疫苗具有重要的理论和实践意义,是我国布病防控研究的重点领域。本研究的主要目的是在构建出羊布鲁氏菌UGPase缺失株的基础上,制备菌壳疫苗株,研究其免疫原性,为布病分子标记菌壳疫苗的研制奠定基础。UGPase是我们课题组在前期比较蛋白质组学研究中发现的一种在强毒株中高表达,疫苗株中低表达的蛋白,经鉴定证实该蛋白是尿苷三磷酸-葡糖糖-1-磷酸-尿苷酰基转移酶(UTP-glucose-1-phosphateuridyly ltransferase,UGPase),是一个与糖原合成相关的酶。细菌菌壳(Bacterial ghosts)是缺失了细胞内容物(胞浆、核酸等),无繁殖能力的细菌空壳。自然环境中的菌壳是大肠杆菌在感染了噬菌体Phi X174后,细胞裂解而形成的;人工制备菌壳主要是利用基因工程技术,让噬菌体Phi X174的裂解基因E在靶细胞内表达,在菌体表面形成40-200nm直径的跨膜孔道,致使菌体内外渗透压改变,内容物外流形成空壳形态。细菌在形成菌壳的过程中不经历物理和化学变性处理,从而保留了天然的细菌胞膜和表面抗原结构,免疫原性得以保留,目前作为一种新型候选疫苗,广泛应用在多种革兰氏阴性细菌的研究当中。本研究利用同源重组方法,构建了含UGPase基因的重组自杀性质粒p BK-S-F-R,在自杀性质粒的介导下与等位基因进行交换,运用两步筛选法对重组菌经行筛选,经PCR鉴定表明ΔUGP缺失株构建成功。随后分别用布鲁氏菌16M株、ΔUGP缺失株、M5疫苗株对小鼠巨噬细胞RAW264.7进行了粘附侵袭实验和动物攻毒试验,结果表明ΔUGP缺失株与强毒株16M在对寄主细胞的侵袭粘附能力和毒力上都没有显著差异。为了探讨缺失基因UGPase是否可作为候选疫苗标记的可能,本研究将含有温控裂解功能的广宿主表达质粒p BBR1MCS-2-TLC,点击转化入ΔUGP缺失株,通过诱导、筛选,制备了羊布鲁氏菌ΔUGP菌壳疫苗株。接着,对布鲁氏菌菌壳疫苗株的溶菌动力学进行试验分析,经诱导条件优化,在培养至OD600值为0.5时进行诱导,诱导48h后,可制备得到裂解率达99.99%的羊布鲁氏菌菌壳,所制菌壳数约为5.62×109cfu/m L。通过对过羊布鲁氏菌ΔUGP株菌壳疫苗、羊布鲁氏菌16M甲醛灭活疫苗和羊布鲁氏菌M5弱毒苗抗体消长规律和小鼠脾T淋巴细胞亚群的研究分析,证实了该菌壳具有良好的免疫原性。综上结果,得出以下结论:1.成功构建了强毒株羊布鲁氏菌16MUGPase基因缺失株,首次证实UGPase与布鲁氏菌毒力相关性不显著。2.研制了羊布鲁氏菌UGPase缺失菌壳疫苗株,裂解率可达99.99%。3.研制的菌壳疫苗具有良好的免疫原性。
【关键词】：羊布鲁氏菌 菌壳疫苗株 毒力 免疫原性 溶菌动力学
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文献综述10-19
• 第一章 布鲁氏菌病及其研究概况10-16
• 1.1 布鲁氏菌病的分布及其危害10-11
• 1.2 人间布病11
• 1.3 布病的主要毒力因子11-14
• 1.4 布鲁氏菌病疫苗14-16
• 第二章 细菌菌壳技术研究进展16-19
• 2.1 菌壳的裂解机理16-17
• 2.2 菌壳的制备及应用17
• 2.3 菌壳疫苗的优缺点17-19
• 第二篇 研究内容19-50
• 第一章 羊布鲁氏菌 16MΔUGP株的构建及鉴定19-28
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-23
• 1.3 结果23-26
• 1.4 讨论26-27
• 1.5 小结27-28
• 第二章 羊布鲁氏菌 16MΔUGP株的毒力实验28-34
• 2.1 材料28
• 2.2 方法28-29
• 2.3 结果29-32
• 2.4 讨论32-33
• 2.5 小结33-34
• 第三章 羊布鲁氏菌 16MΔUGP菌壳的制备及溶菌动力学研究34-43
• 3.1 材料34
• 3.2 方法34-36
• 3.3 结果36-41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 小结42-43
• 第四章 羊布鲁氏菌 16MΔUGP-BG的免疫特性研究43-50
• 4.1 材料43-44
• 4.2 方法44-45
• 4.3 结果45-48
• 4.4 讨论48-49
• 4.5 小结49-50
• 结论50-51
• 参考文献51-59
• 附录59-60
• 作者简介60-61
• 致谢61

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本文编号：1001292