稳定pH值有助于延长猪精液保存时间

    随着经济水平的提高,生产和生活中对于肉类食品需求大大提高,而且随着运输条件,保存条件以及肉类价格上调的影响,越来越多的目光聚焦于如何提高肉类产量与质量上面。因此,如何提升肉畜的品质成为当务之急,而其中的关键之一便是如何提高优秀种畜的利用率。随后,人工授精技术应运而生,人工授精技术是指在种畜与受体母畜之间没有直接的配种技术,而经过人工获取精液而进一步注入母畜体内,帮助母畜受孕的过程。精液保存技术作为人工授精技术的核心技术之一,最开始是采用稀释液而存在,这样能够将种猪一次射出的精液用于多只母畜受孕。随后,研究人员发现稀释液的成分很大程度上影响着母畜受孕率以及产仔数。因而,世界各地掀起了一场稀释液成分研究的热潮。研究人员主要着手的方面在于保存液的能源物质,渗透压以及其他修饰成分,这些成分包括抗氧化剂,螯合剂以及质膜保护剂。刚刚射出的猪精液pH值在7.2到7.5之间。当保存液中存在葡萄糖的情况下,保存液pH值能够在20小时之内迅速降低到6.2左右。尽管研究人员普遍认为低pH值能够降低精子运动能力与代谢水平从而有利于维持保存和操作过程中精子活力,但是代谢过程中产生的酸会导致精子酸中毒从而不利于精液长期保存。因而适当的在保存液中添加缓冲物质是必要的。前期研究证实了精液保存过程中保存液的初始pH值对于维持操作或者保存过程中精子活力非常重要。但是对于保存过程中pH值的变化还没有详细报道,因而定期检测保存液pH值,建立一个pH值随时间变化的非线性模型对于优化猪精液长期液态保存具有非常重要的意义。本试验通过使用Androhep做为基础保存液,首先证实了初始pH值在6.4～6.5之间对于精液保存有最好的保存效果,随后建立精子活力-pH值随时间变化非线性模型,进一步验证了pH值与精子活力变化之间的关系,通过数据分析二者相关系数r=0.954相关性显著,随后通过换液方式稳定pH值,发现换液方式能够有效地提高精子活力显著提高精液保存时间,因而根据缓冲范围我们采用了一种最近兴起的缓冲物质2-吗啉乙磺酸(MES)。MES的最佳缓冲范围为5.7～6.7之间,具有缓冲容量大,缓冲范围广且无生物毒性的优点。改良型缓冲液称为Andromes,在保存过程中Andromes能够显著提高精子活力延长保存时间。我们还比较了三种不同的缓冲物质对猪精液液态保存的影响,还检测了与精子质量有重要关系的精子运动参数、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性。结果证实:(1)精液保存过程中精子活力的降低与pH值降低具有密切关系。(2)猪精液最佳保存初始pH值在6.40～6.50之间,当pH值过高或者过低时都导致精子活力下降,不利于精液保存。(3)Androphep、Androptris相比Andromes保存液能够提高猪精液保存效果。(4)稳定pH值能够有效地提高精子保存效果和体外受精能力。

 

 

页数：52

 

【学位级别】：硕士

【部分图文：】

引言精浆混合，形成精液。精液中精浆为碱性，精子混合后精子从弱酸性条件下谢能力与运动能力[76]。但是在长期保存过程中精子代谢葡萄糖产生以乳酸物，过多的酸性代谢产物能够导致精子在保存过程中代谢降低甚至酸中毒液中添加缓冲物质对于维持精液保存过程中维持精子活力非常重要[77]。目的缓冲物质包含柠檬酸钠，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，酒石酸钾钠。目前三羟基氨基甲烷（Tris）添加到保存液中，Tris 是一种碱性缓冲剂，对于精毒和酸中毒具有非常有效的缓冲作用[]。保存液中添加的缓冲剂通常都是两檬酸钠，HEPES，三羟基氨基甲烷，NaHCO3，酒石酸钾钠，磷酸二酸钠合使用更能够有效地提高保存液的缓冲效果。实验室常用缓冲物液成分及，图 1-1。

子活力检测温度从 30℃降到设定温度后的检测值记为第 0 天的检测值，保存 24 h 的记为存天数以此类推。检测时把保存稀释液混匀取出 1 mL 放入 37℃恒温培养箱中使用清华同方精子活力检测系统（MX7.5）检测精子活力和活率。检精子数不子。检测方法是，将精液保存液放入培养箱孵育 20 到 30 分钟后，轻轻混匀，用轻吸取中层精液 5μl，放入预热好的精子计数池之中，盖好盖玻片，将精子计镜物镜下，调好焦距，运行精子活力检测系统，检查原始参数是否与预设值相视野数：6；采样间隔帧：1 毫秒；最大面积：80 微米；最小面积 15 微米；精5 微米/秒；精子最大速度：150 微米/秒；图像阈值修正：30；图像比例尺：32不小于 200 个。A 级：25 微米/秒，B 级：15 微米/秒，C 级：5 微米/秒，D密度修正系数：2.3239），运行系统开始检测，采集 6 个视野至少 200 个精动状态进行分析，剔除杂质以及分析准确度不高的精子，保存并打印结果。根织的标准，精子运动能力分为四种，分别为 a：快速向前进行直线运动的精子运动的精子；c：运动路线不正确或者原地抖动的精子；d：不运动精子。其中比例为 a+b，精子存活数量比例为 a+b+c。见图 2-1。

PBS 盐溶液中，小心迅速混合 5 到 8 下。（2）使用毕后去除上清，下层沉淀物加入 1 mL 多聚甲醛溶液重0 g 离心 5 min，去除上清后，下层沉淀物使用 PBS 重悬获得的液体平铺在载玻片上，室温下干燥。（7）min，使用蒸馏水清洗掉多余染剂。（8）室温下干燥整性检测用低渗肿胀试验检测。在像 1000 毫升三蒸水中加入，检测渗透压约为 100 Osm 无误后，将低渗液装入蓝取与精液保存温度相等的低渗液 230μL 于 EP 管中，放入 37.5℃温箱中孵育 30 到 40 分钟。孵育完成后液，充分混合后取出 5μL，涂在血球计数板上，相差有实验均重复 3 次或者 3 次以上。从精液温度降到 17一天，进行一次 pH 值测定以及活力检测。每次每组

 

文章目录

 

摘要

英文摘要

1 引言

    1.1 人工授精技术的发展

    1.2 精液液态保存技术的发展与应用

    1.3 影响精液体外保存效果的因素

        1.3.1 冷休克

        1.3.2 稀释的影响

        1.3.3 保存液成分

        1.3.4 保存时间

        1.3.5 精子生理状态

    1.4 保存液pH值对精子活力影响

    1.5 精液保存过程中缓冲物质作用

    1.6 精子质量检测

        1.6.1 精子的运动能力

        1.6.2 荧光显微技术检测精子质量

        1.6.3 精子受精和发育能力检测

    1.7 研究目的与意义

2 材料与方法

    2.1 实验动物

    2.2 主要试剂

    2.3 主要仪器

    2.4 主要溶液配制

    2.5 精液采集

    2.6 精液的稀释与分装

    2.7 精液的降温与保存

    2.8 保存液pH值检测

    2.9 精子质量检测

        2.9.1 精子活力检测

        2.9.2 精子顶体完整性检测

        2.9.3 精子质膜完整性检测

        2.9.4 线粒体膜电位检测

        2.9.5 体外受精

    2.10 实验设计

        2.10.1 精液保存最佳初始pH值确认

        2.10.2 保存过程中pH值与精子活力的变化

        2.10.3 稳定保存液pH值

        2.10.4 稀释液缓冲系统的优化

    2.11 统计分析

3 结果与分析

    3.1 液态保存最佳pH值的确定

    3.2 pH值与精子活力的关系

    3.3 换半液稳定pH值对精子活力的影响

    3.4 调节pH值对精子活力的影响

    3.5 稀释液缓冲系统的优化

    3.6 稳定pH值精子对质膜完整性影响

    3.7 稳定pH值对精子顶体完整性影响

    3.8 稳定pH值对精子线粒体膜电位的影响

    3.9 稳定pH值对精子体外受精能力的影响

4 讨论

    4.1 不同初始pH值的精液保存液保存时间与精子活力之间的关系

    4.2 换半液与调节pH对精子活力的影响

    4.3 改进稀释液缓冲系统对精液保存效果的影响

    4.4 稳定pH值对精液保存效果的影响

    4.5 稳定pH值对精子质膜完整性和顶体完整性的影响

    4.6 pH值影响线粒体功能的原因

    4.7 稳定保存液的pH与保存精子受精的能力

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文