鸡、猪、奶牛源大肠杆菌的耐药性与其I类整合子和质粒相关性研究

发布时间：2017-10-09 21:30

  本文关键词：鸡、猪、奶牛源大肠杆菌的耐药性与其I类整合子和质粒相关性研究

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【摘要】：致病性大肠杆菌是一种重要的人畜共患病原菌,可以引起人以及鸡、猪、奶牛等多种动物发生急性、致死性传染病。目前,抗菌药物的使用仍然是防控细菌性疾病的主要措施之一。由于药物使用量的不断加大和耐药基因的扩散和传播,大肠杆菌的耐药性正变得日益严重。病原菌耐药性的传播途径包括基因水平转移和基因突变等,整合子、质粒等可移动遗传因子在大肠杆菌耐药基因的传播中起到了重要的作用。本研究开展了鸡、猪、奶牛源大肠杆菌对18种抗菌药物的耐药性的检测,并探究大肠杆菌耐药表型与其Ⅰ类整合子、18种质粒存在的相关性,为大肠杆菌病的有效防治和耐药机理等研究提供重要参考和理论基础。一、大肠杆菌的耐药性检测采用WHO推荐的K-B纸片扩散法,按CLSI (2012)的判定标准,对分离于江苏省的818株致病性大肠杆菌(鸡源644株、猪源113株、奶牛源61株),进行18种抗菌药物的敏感性检测,并分析其耐药率和多重耐药情况。结果表明,鸡和猪源大肠杆菌的多重耐药率分别为88.2%(568/644)和82.3%(93/113),显著高于奶牛源大肠杆菌的21.3%(13/61)(P0.016)。鸡和猪源大肠杆菌最高耐16种抗菌药物,而奶牛源大肠杆菌最高仅耐11种。鸡和猪源大肠杆菌对临床上常用的氨苄西林、链霉素、四环素、萘啶酸、磺胺异恶唑和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑的耐药率均在50%以上。然而,奶牛源大肠杆菌对抗菌药物比较敏感,仅对氨苄西林和萘啶酸的耐药率超过20%,而对头孢他啶、厄他培南、阿米卡星和安曲南不表现耐药。鸡和猪源大肠杆菌对四环素、萘啶酸和磺胺异恶唑的耐药最为严重,鸡源大肠杆菌耐药率分别为93.5%、81.2%和78.9%,’猪源大肠杆菌耐药率分别为90.2%、84.1%和69.9%,而奶牛源大肠杆菌对四环素、萘啶酸和磺胺异恶唑的耐药率仅为19.7%、21.3%、18.0%。二、大肠杆菌耐药性与Ⅰ类整合子的相关性PCR检测表明,80.9%的大肠杆菌(662/818)携带Ⅰ类整合子。其中,奶牛源菌株Ⅰ类整合子的阳性率为21.3%(13/61),显著低于鸡源菌株的87.0%(560/644)和猪源菌株的76.1%(86/113)(P0.014)。在鸡、猪和奶牛源多重耐药菌株中,Ⅰ类整合子的阳性率分别为93.0%,92.5%和84.6%,而非多重耐菌株Ⅰ类整合子对应的阳性率较低,分别为39.5%,0和4.2%(P104)。大肠杆菌的耐药表型与其Ⅰ类整合子检测结果的相关性分析表明,大肠杆菌对5种抗菌药物的耐药性(氨苄西林、萘啶酸、磺胺异恶唑、恩诺沙星、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑)与Ⅰ类整合子呈现显著正相关(P0.023)。三、大肠杆菌耐药性与质粒的相关性本研究应用三重PCR方法,对随机挑选的255株大肠杆菌(鸡源161株、猪源67株、奶牛源27株)进行质粒检测,5种质粒为阳性,阳性率分别为4.7%(IncHI2)、15.3% (IncI1)、15.7%(IncN)、1.6%(IncA/C)、13.7%(IncY),而没有检测出另外13种质粒(IncB/O、IncFIC、IncP、IncT、IncK/B、IncW、IncFIIA、IncFIA、IncFIB、IncFreP. IncX、IncHI1和IncL/M)。结果表明,在检测出的5种阳性质粒中,4种质粒(IncH12,IncI1, IncN, IncA/C)的存在和大肠杆菌的耐药性呈现显著正相关(P0.049),而1种质粒(IncY)的存在和其耐药性呈现显著负相关(P0.037)。IncHI2阳性的大肠杆菌(n=12)对氯霉素、头孢曲松和头孢噻肟的耐药率较高,分别为83.3%、66.7%和66.7%；而阴性菌株(n=243)对其耐药率仅为41.2%、12.8%和16.5%。IncI1阳性菌株(n=49)对磺胺异恶唑、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑和四环素的耐药率高达97.9%、97.9%和95.9%；而阴性菌株(n=206)对其耐药率仅有77.7%、78.6%和82.5%。IncN阳性菌株(n=40)对磺胺异恶唑、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑和四环素耐药率较高,均为97.5%;而阴性菌株(n=215)对其耐药率只有80.0%、79.5%和87.0%。IncA/C阳性菌株(n=4)对庆大霉素、头孢曲松和头孢他啶耐药率较高,均为75%;而阴性菌株(n=251)对其耐药率只有26.3%、14.3%和8.4%。有趣的是,IncY阳性菌株(n=35)对萘啶酸、恩诺沙星和环丙沙星的耐药率为45.7%、42.8%和45、7%;而阴性菌株(n=220)对其耐药率高达78.2%、52.3%和49.1%。综上所述,本研究对鸡、猪、奶牛源大肠杆菌进行耐药性检测,并探究菌株耐药表型与其Ⅰ类整合子、18种质粒的相关性。鸡和猪源大肠杆菌较奶牛源大肠杆菌表现更高的耐药性和多重耐药率；多重耐药菌株Ⅰ类整合子阳性率是非多重耐药菌株的阳性率2倍以上；大肠杆菌携带4种质粒(IncHI2、IncI1, IncN、IncA/C)的一种或多种时,其耐药性明显增加,具有显著正相关性。本研究检测大肠杆菌的耐药性,并从分子水平探索大肠杆菌耐药性的形成因素,不仅为防治大肠杆菌病的合理用药与科学用药提供重要信息,也为大肠杆菌耐药机理等研究提供理论基础。
【关键词】：抗菌药物 药敏试验 整合子 质粒
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-10
• 符号说明10-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1.1 致病性大肠杆菌研究进展12-15
• 1.1.1 禽致病性大肠杆菌12-13
• 1.1.2 猪致病性大肠杆菌13-14
• 1.1.3 牛致病性大肠杆菌14-15
• 1.2 细菌的耐药现状15-17
• 1.2.1 β-内酰胺类15
• 1.2.2 喹诺酮类15-16
• 1.2.3 氨基糖苷类16
• 1.2.4 四环素类16-17
• 1.2.5 磺胺类药物17
• 1.3 大肠杆菌Ⅰ类整合子的研究现状17-18
• 1.4 大肠杆菌质粒的研究现状18-19
• 第二章 鸡、猪、奶牛源大肠杆菌的耐药性检测19-31
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 菌株19-20
• 2.1.2 试剂20
• 2.1.3 药敏纸片20
• 2.1.4 主要仪器设备20-21
• 2.2 方法21-24
• 2.2.1 培养基的配制21
• 2.2.2 菌株的复苏和纯化21
• 2.2.3 PCR鉴定21-23
• 2.2.4 药敏试验23-24
• 2.3 结果与分析24-29
• 2.3.1 菌株的复苏、纯化24-25
• 2.3.2 PCR鉴定25
• 2.3.3 药敏试验结果与分析25-28
• 2.3.4 多重耐药分析28-29
• 2.4 讨论29-31
• 第三章 大肠杆菌的耐药性与其Ⅰ类整合子相关性研究31-39
• 3.1 材料31-32
• 3.1.1 菌株31
• 3.1.2 试剂和仪器31-32
• 3.2 方法32-33
• 3.2.1 核酸提取32
• 3.2.2 Ⅰ类整合子的检测32-33
• 3.3 结果与分析33-37
• 3.3.1 Ⅰ类整合子的检测33-35
• 3.3.2 大肠杆菌Ⅰ类整合子检测结果及其耐药表型的相关性35-37
• 3.4 讨论37-39
• 第四章 大肠杆菌的耐药性与其质粒相关性研究39-53
• 4.1 材料39-40
• 4.1.1 菌株39-40
• 4.1.2 试剂和仪器40
• 4.2 方法40-42
• 4.2.1 核酸提取40
• 4.2.2 质粒的检测40-42
• 4.3 结果与分析42-51
• 4.3.1 质粒的检测42-44
• 4.3.2 大肠杆菌质粒的检测结果及其耐药表型的相关性44-51
• 4.4 讨论51-53
• 参考文献53-59
• 全文总结59-60
• 致谢60-61
• 攻读学位期间发表论文61-62
• 攻读学位期间获得发明专利62-63

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