鼠源单克隆抗体犬源化的研究

发布时间：2017-10-10 00:07

  本文关键词：鼠源单克隆抗体犬源化的研究

  更多相关文章： 犬细小病毒 双抗体夹心ELISA 重叠延伸PCR 犬-鼠嵌合抗体 真核表达

【摘要】：犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)为细小病毒科细小病毒属的成员,病毒粒子无囊膜,核衣壳为等轴对称的二十面体,对外界抵抗力强,CPV只有CPV-2一个抗原型,该病传染性强,发病迅猛,病情严重,死亡率高,犬之间通过直接或间接接触而传播该病?发病犬有两种表现型:心肌炎型与肠炎型?肠炎型以严重的呕吐与严重的出血性腹泻为主;心肌炎型以幼犬呼吸与心血管的衰竭为主要特征?犬细小病毒病治疗尚无特效药物,临床治疗时采用对症治疗?支持疗法和特异性疗法结合应用?其中特异性疗法主要采用注射高免血清和单克隆抗体进行治疗,在CPV感染早期,单克隆抗体治疗效果显著,然而鼠源单克隆抗体的异源性在临床治疗引起宿主免疫反应,使单抗疗效降低,甚至诱发严重的免疫反应?因此有必要对其进行改造,为此本研究首先建立了检测犬免疫球蛋白G(IgG)的双夹心ELISA方法,而后构建嵌合抗体全长基因质粒并在哺乳动物细胞表达,为后期建立稳定表达犬-鼠嵌合抗体细胞系奠定基础,为以后开发犬细小病毒病抗体药物治疗提供支持。本研究以兔抗犬IgG Fc段多克隆抗体为包被抗体,过氧化酶标记的兔抗犬IgG(全分子)多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA定量检测方法,并采用Protein A方法从犬血清中纯化犬IgG作为ELISA检测标准品?该检测方法与小鼠?兔?马?牛?鸡及羊常见动物血清无交叉反应,特异性好;最低检测下限可以达到4.8 ng/m L,敏感性较高?目的在于提供一种检测犬IgG的检测方法以及便于后期检测犬-鼠嵌合抗体的表达和筛选稳定表达犬-鼠嵌合抗体的细胞系?本研究成功从杂交瘤细胞扩增了抗体重链轻链可变区,经IMGT网站分析所扩增的序列具有抗体功能,从犬外周血单个核细胞(PBMC)中扩增了犬IgG重链轻链恒定区,经NCBI进行Blast分析与犬IgG重链轻链基因同源性均在99%以上,并通过重叠延伸PCR成功拼接为嵌合序列,定向克隆至pcDNA3.1(+)载体上,重组质粒转染CHO细胞后,经ELISA检测成功表达,并纯化了嵌合抗体,本研究为犬-鼠嵌合重组抗体表达方法的建立提供了实验支持,也为今后下一步鉴定抗体效力和功能以及建立稳转细胞系奠定了一定的物质基础。
【关键词】：犬细小病毒 双抗体夹心ELISA 重叠延伸PCR 犬-鼠嵌合抗体 真核表达
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
【目录】：

• 中文摘要6-7
• Summary7-9
• 缩略词9-10
• 第一章 前言10-20
• 1.1 犬细小病毒的研究进展10-14
• 1.1.1 病原学10-11
• 1.1.2 流行病学11
• 1.1.3 临床症状11-12
• 1.1.4 病理变化12
• 1.1.5 诊断12-13
• 1.1.6 防治13-14
• 1.2 单克隆抗体药物的研究进展14-17
• 1.2.1 鼠源单克隆抗体14-15
• 1.2.2 人源化嵌合抗体15
• 1.2.3 人源化改型抗体15-16
• 1.2.4 全人源抗体16-17
• 1.2.5 抗体药物的未来展望17
• 1.3 重组抗体技术的研究进展17-19
• 1.4 本研究的目的与意义19-20
• 第二章 检测犬免疫球蛋白G的夹心ELISA方法的建立20-34
• 2.1 材料与设备20-22
• 2.1.1 实验材料和试剂20-22
• 2.1.2 主要设备和仪器22
• 2.2 方法22-25
• 2.2.1 犬血清中IgG的获得和浓度测定22-23
• 2.2.2 犬IgG纯度鉴定23
• 2.2.3 ELISA方法建立23-24
• 2.2.4 特异性试验24-25
• 2.2.5 敏感性试验25
• 2.2.6 犬细小阳性血清和阴性血清IgG含量比较25
• 2.3 结果25-32
• 2.3.1 纯化IgG浓度测定25-26
• 2.3.2 纯化IgG纯度测定26-27
• 2.3.3 ELISA方法最优条件的确立27-30
• 2.3.4 特异性试验30-31
• 2.3.5 敏感性试验31-32
• 2.3.6 细小阳性血清和阴性血清IgG含量比较32
• 2.4 讨论32-34
• 第三章 嵌合抗体重链?轻链全长基因的扩增与重组质粒的构建34-53
• 3.1 材料与设备34-35
• 3.1.1 细胞?质粒及主要试剂34
• 3.1.2 主要仪器设备34-35
• 3.2 方法35-47
• 3.2.1 鼠源单克隆抗体轻链?重链可变区的扩增35-39
• 3.2.2 犬源抗体轻链?重链恒定区的扩增39-40
• 3.2.3 犬-鼠嵌合抗体轻链?重链全长序列的扩增40-46
• 3.2.4 重组质粒的构建46
• 3.2.5 重组质粒的小量提取46
• 3.2.6 重组质粒的鉴定46-47
• 3.3 结果47-51
• 3.3.1 杂交瘤细胞基因可变区的扩增47
• 3.3.2 杂交瘤细胞基因可变区的序列分析47-48
• 3.3.3 犬IgG抗体恒定区基因的扩增48-49
• 3.3.4 犬-鼠嵌合抗体重链?轻链全长基因的扩增49-50
• 3.3.5 重组质粒的酶切鉴定50-51
• 3.4 讨论51-53
• 第四章 嵌合抗体的表达与纯化53-65
• 4.1 材料53-55
• 4.1.1 细胞?质粒和主要试剂53
• 4.1.2 细胞表达所用试剂53
• 4.1.3 ELISA所用试剂53-54
• 4.1.4 嵌合抗体纯化所用试剂54
• 4.1.5 主要仪器54-55
• 4.2 方法55-60
• 4.2.1 重组质粒的的大量提取55-56
• 4.2.2 CHO细胞的复苏56
• 4.2.3 CHO细胞的培养56
• 4.2.4 细胞的转染56-57
• 4.2.5 ELISA检测57-58
• 4.2.6 犬-鼠嵌合抗体纯化58
• 4.2.7 犬-鼠嵌合抗体纯化的鉴定58-60
• 4.3 结果60-63
• 4.3.1 ELISA检测重组质粒的表达60-61
• 4.3.2 嵌合抗体的纯化结果61-63
• 4.4 讨论63-65
• 第五章 全文结论65-66
• 参考文献66-69
• 致谢69-70
• 附录Ⅰ70-71

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本文编号：1003185