奶牛乳腺上皮细胞miR-214靶基因的鉴定及其对免疫调节的初步研究

发布时间：2017-10-10 14:42

  本文关键词：奶牛乳腺上皮细胞miR-214靶基因的鉴定及其对免疫调节的初步研究

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【摘要】：miRNA是一类具有调控作用的非编码微小RNA,其长度一般为20~25个碱基。miRNA通常通过碱基互补配对的方式与靶基因的3’非编码区结合,抑制靶m RNA的表达或是蛋白的翻译过程,从而对靶基因进行调控。本研究通过向293A细胞系共转染miR-214的类似物和靶基因重组双荧光素酶报告基因载体,48h后检测靶基因双荧光素酶活性来初步筛选miR-214潜在的靶基因,并向奶牛乳腺上皮细胞中转染miR-214的类似物及阻抑物,即分别对奶牛乳腺上皮细胞中的miR-214进行过表达和干扰表达,24h后提取细胞总RNA并反转录为cDNA,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测靶基因及其下游通路基因和炎症因子的表达量。主要结果如下:1、转染293A试验中,miR-214 mimics实验组NFATc3、TRAF3双荧光素酶活性比转染miR-214 mimics control的对照组极显著降低(p0.01),TOLLIP、IGDCC3、NFATc4、IL17RD的表达量实验组和对照组没有显著变化。我们推测,NFATc3、TRAF3是miR-214的靶基因。2、转染乳腺上皮细胞试验中,mi R-214 mimics实验组靶基因NFATc3、TRAF3及其下游信号通路基因MAP3K14、TBK1和炎症因子IL-6、IL-1β基因的表达量比转染miR-214mimics control的对照组极显著降低(p0.01),而且miR-214 inhibitor实验组靶基因NFATc3、TRAF3及其下游信号通路基因MAP3K14、TBK1和炎症因子IL-6、IL-1β基因的表达量比转染miR-214 inhibitor control的对照组显著升高(p0.05)。该研究结果证明在奶牛乳腺上皮细胞中,miR-214显著抑制靶基因NFATc3、TRAF3的表达,并间接抑制其下游信号通路基因MAP3K14、TBK1和炎症因子IL-6、IL-1β基因的表达。综上所述,本研究从细胞水平上探讨了mi R-214在奶牛乳房炎中的作用及分子机制,研究结果为奶牛乳房炎的分子调控网络解析积累资料,为乳房炎抗性分子育种提供新的分子依据和科学指导。
【关键词】：miR-214 奶牛乳腺上皮细胞 双荧光素酶分析 qRT-PCR
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-10
• 第一章 文献综述10-17
• 1.1 miRNA的研究进展10-12
• 1.1.1 miRNA的发现10
• 1.1.2 miRNA的作用机制10-11
• 1.1.3 miRNA的检测方法11
• 1.1.4 miRNA在动物中研究进展11-12
• 1.1.5 miRNA对奶牛乳房炎调控机制的研究12
• 1.2 miRNA靶基因的预测与鉴定12-13
• 1.2.1 生物信息学预测12-13
• 1.2.2 生物学实验预测13
• 1.2.3 miRNA靶基因的鉴定13
• 1.3 miR-214对免疫途径的调节及意义13-14
• 1.4 miR-214靶基因的研究进展14-15
• 1.4.1 TRAF3的研究进展14
• 1.4.2 NFATc3的研究进展14-15
• 1.5 研究的目的和意义15
• 1.6 研究的技术路线15-17
• 第二章 miR-214靶基因的鉴定17-26
• 2.1 材料和方法17-21
• 2.1.1 主要试剂和试剂盒17
• 2.1.2 miR-214靶基因的预测17
• 2.1.3 构建双荧光素酶报告基因载体17-20
• 2.1.4 293A细胞系的转染20
• 2.1.5 测定酶活20-21
• 2.1.6 统计分析21
• 2.2 结果与分析21-24
• 2.2.1 靶基因的预测21
• 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告基因重组载体鉴定21-23
• 2.2.3 不同靶基因与miR-214作用验证结果23-24
• 2.3 讨论24-25
• 2.4 小结25-26
• 第三章 过表达和干扰miR-214对奶牛乳腺上皮细胞的影响26-34
• 3.1 材料和方法26-29
• 3.1.1 主要试剂和试剂盒26
• 3.1.2 miR-214 mimics转染奶牛乳腺上皮细胞26-27
• 3.1.3 miR-214 mimics对其靶基因及通路基因和炎症因子表达的影响27-28
• 3.1.4 miR-214 inhibitor转染奶牛乳腺上皮细胞28-29
• 3.1.5 miR-214 inhibitor对其靶基因及通路基因表达的影响29
• 3.1.6 统计分析29
• 3.2 结果与分析29-32
• 3.2.1 过表达和干扰表达miR-214后奶牛乳腺上皮细胞总RNA质量检测29-30
• 3.2.2 过表达miR-214对其靶基因及通路基因和炎症因子表达的影响30-31
• 3.2.3 干扰表达miR-214对其靶基因及通路基因和炎症因子表达的影响31-32
• 3.3 讨论32-33
• 3.4 小结33-34
• 第四章 结论及展望34-35
• 4.1 研究结论34
• 4.2 主要创新点34
• 4.3 需要进一步研究的问题34-35
• 参考文献35-40
• 附录40-49
• 致谢49-50
• 作者简介50

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本文编号：1006956