广西部分地区食源性溶血链球菌的分离鉴定及其CPS2J毒力基因的克隆及序列分析

发布时间：2017-10-10 19:16

  本文关键词：广西部分地区食源性溶血链球菌的分离鉴定及其CPS2J毒力基因的克隆及序列分析

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【摘要】：本文拟对广西部分区域内食源性溶血链球菌的流行情况及其分子生物学特性等进行研究,为广西食源性病原菌的流行病学和建立广西畜禽产品食源性致病菌的菌种库和基因信息库提供科学依据。方法：(1)采用常规细菌分离培养、生化试验、动物毒力试验和PCR鉴定对2014年9月至2016年3月在广西部分地区的农贸市场上采集到1257份生鲜肉样品进行溶血链球菌的分离、鉴定,同时采用K-B纸片扩散法对溶血链球菌分离菌株进行药敏试验。(2)参考GenBank上已发表的链球菌CPS2J毒力基因序列设计合成引物,扩增长度为1152bp,采用PCR方法对60株溶血链球菌分离菌株进行CPS2J毒力基因扩增、克隆、序列测定,得出45株目的菌,并对其核苷酸序列进行同源性分析比较。结果：(1)通过常规细菌分离鉴定,从1257份生鲜肉样品中分离得到溶血性链球菌60株,其中柳州市12株、桂林市27株、来宾市9株、上林市7株、南宁市5株。选取其中11株分离菌株接种小白鼠,8h至24h后动物死亡,结果表明分离到的11株溶血链球菌分离菌株对小白鼠均有较强的致病性。(2)药敏试验结果显示,桂林市、来宾市、上林市、南宁市和柳州市分离菌株对阿莫西林的耐药率分别达59%、33%、43%、40%和42%；桂林市和来宾市分离菌株对克林霉素的耐药率分别达15%和11%；桂林市、来宾市、上林市、柳州市分离菌株对青霉素的耐药率分别达41%、22%、29%、58%；桂林市、上林市、南宁市和柳州市分离菌株对万古霉素的耐药率分别达19%、29%、20%和17%；桂林市分离菌株对庆大霉素的耐药率达11%。(3)60株溶血链球菌分离菌株中经PCR方法扩增出CPS2J毒力基因的有45株,将其与国内外标准菌株进行核苷酸序列同源性比较,结果显示,与国内外标准菌株98015、SC17、SC22、SC152和ZYS8比较,来宾8株分离菌株(GLB-5、GLB-9、GLB-12、GLB-13、GLB-15、GLB-25、GLB-26、GLB-33)的CPS2J核苷酸同源性为84.4%-96.7%,柳州9株分离菌株(G17-1、G17-2-3、G17-3、GLZ-6、GLZ-8、G17-11、GLZ-14、GLZ-22、G17-23)的同源性为84.4%-96.7%,上林4株分离菌株(GSL-1、GSL-2、GSL-7、GSL-13)的同源性为84.2%-96.5%,桂林22株分离菌株(GGL-2、GGL-2-2、GGL-2-4、GGL-2-10、GGL-2-16、GGL-2-18、GGL-2-28、GGL-3-4、GGL-3-19、GGL-4、GGL-4-1、GGL-4-2、GGL-4-5、GGL-7、GGL-10、GGL-12、GGL-13、GGL-18、GGL-24、GGL-26、GGL-27、GGL-29)的同源性为79.8%-96.5%,南宁市2株分离菌株(GDST-2-2, GDST-5)的同源性为81.2%-90.5%；与国际标准菌株98015、SC17、SC22、5C152比较,来宾8株分离菌株同源性为83.7%-96.3%,柳州9株分离菌株的同源性为84.4%-96.7%,上林4株分离菌株同源性为84.2%-96.5%,桂林22株分离菌株同源性为79.8%-96.5%,南宁市2株分离菌株同源性为81.2%-90.5%；与国内标准菌株ZYS8比较,来宾6株分离菌株的同源性为84.8%-94.8%,柳州9株分离菌株的同源性为85.8%-95.4%,上林4株分离菌株同源性为85.6%-96.3%,桂林22株分离菌株同源性为84.2%-93.6%,南宁市2株分离菌株同源性为81.2%-90.5%；桂林22株分离菌株与上林4株分离菌株的CPS2J核苷酸比较,同源性为86.7%-99.9%,桂林22株分离菌株与柳州9株分离菌株的CPS2J核苷酸比较,同源性为77.8%-100%；国内外标准菌株98015、SC17、SC22、SC152和ZYS8,亲缘关系较近。但广西分离菌株GGL-2-4、GGL-20-1、GLZ-2相对独立,与国内外菌株亲缘关系相对较远。ZYS8菌株与GLB-25菌株以及GGL-26菌株亲缘关系较近,SC152菌株与GGL-27菌株亲缘关系较近。结论：从广西部分地区采集的1257份生鲜肉样品中分离到的60株溶血链球菌分离菌株,部分具有明显的耐药性。60株中有45株含有CPS2J毒力基因,并对小鼠具有较强的致病性,这45株分离菌株CPS2J毒力基因的核苷酸与国内外标准毒株比较,其同源性存在一定差异,为建立广西畜禽产品食源性致病菌风险评估及预警技术体系奠定理论基础。
【关键词】：溶血性链球菌 PCR CPS2J 毒力因子 检测
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 缩略语表(Abbreviation)15-16
• 第一章 综述16-32
• 1.1 猪链球菌的研究进展16-19
• 1.1.1 猪链球菌的病原学特征17
• 1.1.2 猪链球菌的流行病学研究17-19
• 1.2 猪链球菌抗原结构的分类19
• 1.3 猪链球菌的毒力因子19-24
• 1.3.1 荚膜多糖20-21
• 1.3.2 溶菌酶释放蛋白及胞外因予21-22
• 1.3.3 溶血素22
• 1.3.4 粘附素22
• 1.3.5 谷氨酸脱氢酶22-23
• 1.3.6 纤维蛋白原结合蛋白23
• 1.3.7 毒力岛23-24
• 1.3.8 其他毒力因子24
• 1.4 溶血性链球菌24-26
• 1.5 猪链球菌的检测方法26-29
• 1.5.1 分离鉴定法26
• 1.5.2 血清学检测方法26-27
• 1.5.3 分子生物学检测方法27-29
• 1.6 临床症状及病理变化29-30
• 1.6.1 急性败血型29
• 1.6.2 脑膜炎型29
• 1.6.3 关节炎型29-30
• 1.7 猪链球菌的防治30
• 1.8 本研究的目的和意义30-31
• 1.9 本研究技术路线图31-32
• 第二章 广西部分区域食源性溶血链球菌的分离与鉴定32-42
• 2.1 材料32-34
• 2.1.1 样品来源32
• 2.1.2 主要试剂32-33
• 2.1.3 培养基配制33
• 2.1.4 主要仪器33-34
• 2.2 方法34-36
• 2.2.1 样品的处理34
• 2.2.2 分离培养34
• 2.2.3 涂片镜检34
• 2.2.4 生化特性34
• 2.2.5 PCR检测34-36
• 2.3 结果36-39
• 2.3.1 细菌的形态特征36-37
• 2.3.2 生化鉴定37-38
• 2.3.3 PCR鉴定38-39
• 2.4 分析与讨论39-41
• 2.5 本章小结41-42
• 第三章 溶血链球菌分离菌株的药敏试验42-52
• 3.1 材料42
• 3.1.1 菌液42
• 3.1.2 药敏片42
• 3.1.3 血平板42
• 3.2 方法42-43
• 3.3 结果43-49
• 3.4 分析与讨论49-50
• 3.5 本章小结50-52
• 第四章 溶血链球菌分离菌株的动物毒力试验52-58
• 4.1 材料52-53
• 4.1.1 攻毒菌液的制备52
• 4.1.2 试验动物52
• 4.1.3 试剂52
• 4.1.4 主要仪器52-53
• 4.2 方法53
• 4.3 结果53-56
• 4.4 分析与讨论56-57
• 4.5 本章小结57-58
• 第五章 食源性溶血链球菌CPS2J毒力基因的克隆及序列分析58-71
• 5.1 材料58-59
• 5.1.1 试验菌株58
• 5.1.2 主要试剂及配制58
• 5.1.3 培养基58-59
• 5.2 方法59-62
• 5.2.1 溶血型链球菌CPS2J部分基因片段PCR检测59-61
• 5.2.2 链球菌CPS2J部分基因片段序列测定61-62
• 5.3 结果62-68
• 5.3.1 溶血链球菌CPS2J毒力基因的扩增结果62-63
• 5.3.2 溶血链球菌CPS2J毒力基因的核苷酸同源性比较结果63-66
• 5.3.3 遗传进化分析66-68
• 5.4 分析与讨论68-70
• 5.5 本章小结70-71
• 第六章 全文结论71-72
• 参考文献72-82
• 致谢82-83
• 攻读硕士期间发表论文情况83

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本文编号：1008123