鹅Ⅰ型和Ⅱ型干扰素免疫学特性及抗病毒功能研究

发布时间：2017-10-11 17:08

  本文关键词：鹅Ⅰ型和Ⅱ型干扰素免疫学特性及抗病毒功能研究

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【摘要】：干扰素(IFN)是一类有效的抗病毒免疫蛋白,在外来病毒感染宿主的过程中,干扰素与其同源受体发生结合而活化特定的STAT分子从而启动干扰素刺激基因的转录和表达。本研究对鹅Ⅰ型和Ⅱ型干扰素受体(IFNR)进行了基因鉴定,探究了IFNα、 IFNy及其同源受体组织表达规律,并成功表达鹅IFNα、IFNy重组蛋白,从干扰素及相关免疫信号因子调控、病毒感染及抗原定位、干扰素抗病毒效应等多方面解析了鹅干扰素免疫学活性和抗病毒功能。获得结果如下：1.Ⅰ型与Ⅱ型干扰素受体的分子克隆本研究通过cDNA末端快速扩增技术克隆了四川白鹅IFNAR1 (1616 bp)、 IFNAR2 (1525 bp)、IFNGR1 (1322 bp)、IFNGR2 (1438bp)基因的全序列,上传至NCBI获得Genbank序列号为IFNAR1(KM504097)、IFNAR2(KM504096)、IFNGR1(KM457284)、IFNGR2(KM461716)。经蛋白结构域分析及分子进化树分析表明禽类干扰素受体分子结构相似,进化关系接近。2.Ⅰ型与Ⅱ型干扰素及其受体的组织表达谱与免疫学特性研究采用荧光定量PCR检测方法对1周龄雏鹅探究了IFN及其受体免疫基因的组织表达谱,分析发现IFNα、IFNy及其受体亚基在免疫相关组织中表达较高。在体外实验中,不同的免疫激动剂均可上调鹅外周血淋巴细胞中干扰素基因的表达量,证明了鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素对TLRs激动剂的免疫特性。3.H9N2、TMUV、GPV病毒感染对干扰素表达的影响利用H9N2、GPV和TMUV人工感染雏鹅,通过免疫组化和荧光定量PCR技术分别检测了不同器官的抗原信号和干扰素转录水平。H9N2禽流感病毒的抗原信号在脾脏、法氏囊、小肠、大肠、肺脏、气管和肝脏中明显。GPV感染组中,,在肝脏、肺脏、小肠、大肠、均有较强的GPV信号。TMUV感染组中,肝脏、脑、脾脏、小肠均检测到较强的TMUV阳性信号与CD8阳性信号。在感染GPV或TMUV试验动物中,IFNγ在免疫组织(脾脏、胸腺、哈德氏腺)和非免疫组织(小肠、肝脏、肺脏)的表达量均高于对照组,且鹅IFNγ与CD8和病原阳性信号分布和强度相关联。此外,H9N2、GPV或TMUV病毒孵育外周血淋巴细胞后,均能显著上调IFNα与IFNγ的表达。4.1型与Ⅱ型干扰素蛋白的亚细胞定位研究以荧光质粒作为骨架载体,重组质粒pEGFP-IFNα和pEGFP-IFNγ成功构建并在BHK21细胞中有效表达,其大小分别约为46 kDa和44 kDa。IFNα蛋白主要以点状、环状、聚集状,分布于细胞核周围。IFNγ蛋白主要表现为点状、团状、散在的星状结构,广泛分布于细胞核和细胞质。5.真核表达质粒的构建和重组蛋白的表达经PCR和酶切鉴定,表明pcDNA3.1-IFNα与pcDNA3.1-IFNγ质粒构建成功。对体外培养BHK21细胞转染质粒,并经免疫印迹验证确认pcDNA3.1-IFNα与pcDNA3.1-IFNγ质粒可在BHK21细胞中成功表达,重组鹅IFNα与IFNγ蛋白分别约为20 kDa和18 kDa,重组蛋白均在转染24小时后表达量较高。6.鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素蛋白的抗病毒活性研究运用免疫印迹、定量PCR和流式细胞仪分析技术,对鸭瘟病毒的标签荧光蛋白、病毒拷贝数、病毒滴度进行测定,发现外源鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素蛋白均可有效抑制鸭瘟病毒在DEF中的增殖和复制,证明了鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素蛋白具有抗病毒功能。另外,鹅源干扰素可诱导鸭源细胞中干扰素及其抗病毒基因的转录上调,表明其在鸭源细胞中也具有生物学活性。本研究为进一步研究重组鹅干扰素的抗病毒功能及其应用奠定了基础。
【关键词】：鹅 干扰素及其受体 组织分布 免疫学特性 抗病毒功能
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.33
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英语缩写词汇及其符号说明7-12
• 第一章 文献综述12-18
• 1 IFN及其特异受体12-13
• 1.1 IFN12
• 1.2 IFNR12-13
• 2 IFN介导的抗病毒信号通路13-14
• 2.1 JAK-STAT通路13-14
• 2.2 IRF调控因子14
• 2.3 正反馈调控机制14
• 3 IFN诱导的主要抗病毒蛋白14-16
• 3.1 PKR14-15
• 3.2 OAS15
• 3.3 Mx15
• 3.4 Viperin15-16
• 4 Ⅰ型和Ⅱ型IFN免疫活性及抗病毒活性16-17
• 5 研究目的和意义17-18
• 第二章 鹅IFNα和IFNγ受体的分子克隆18-26
• 1 材料18
• 1.1 菌株与质粒18
• 1.2 实验动物18
• 1.3 实验试剂18
• 1.4 主要溶液及其配制18
• 1.5 主要仪器设备18
• 2 方法18-20
• 2.1 引物的设计与合成18-20
• 2.2 保守区克隆20
• 2.3 序列末端克隆20
• 2.4 生物信息学分析20
• 3 结果20-25
• 3.1 保守序列扩增电泳结果20-21
• 3.2 基因全长序列扩增电泳结果21
• 3.3 核酸与氨基酸序列分析21-23
• 3.4 结构域分析23
• 3.5 系统进化分析23-25
• 4 讨论25-26
• 第三章 鹅IFN及其受体的组织表达谱与免疫特性研究26-32
• 1 材料26
• 1.1 主要实验试剂26
• 1.2 实验动物26
• 1.3 主要仪器设备26
• 2 方法26-28
• 2.1 组织分离及研磨26
• 2.2 总RNA抽提26-27
• 2.3 反转录27
• 2.4 外周血淋巴细胞分离27
• 2.5 荧光定量PCR27-28
• 3 结果28-31
• 3.1 Ⅰ型与Ⅱ型干扰素及其受体组织表达谱28-29
• 3.2 Ⅰ型与Ⅱ型干扰素体外免疫特性29-31
• 4 讨论31-32
• 第四章 不同病毒感染对鹅干扰素表达的影响32-44
• 1 材料32
• 1.1 实验毒株与动物32
• 1.2 实验试剂32
• 1.3 主要仪器32
• 2 方法32-34
• 2.1 实验设计32-33
• 2.2 组织样本采集33
• 2.3 免疫组化染色33-34
• 3 结果34-41
• 3.1 H9N2病毒抗原定位与干扰素的表达34-37
• 3.2 TMUV与GPV病毒抗原定位与干扰素的表达37-41
• 4 讨论41-44
• 4.1 H9N2感染对宿主抗病毒免疫反应的影响41-42
• 4.2 TMUV与GPV感染对宿主抗病毒免疫反应的影响42-44
• 第五章 鹅IFNα和IFNγ的亚细胞定位44-49
• 1 材料44
• 1.1 质粒和试剂44
• 1.2 仪器和设备44
• 2 方法44-46
• 2.1 引物设计44
• 2.2 质粒构建44-45
• 2.3 质粒抽取45
• 2.4 细胞转染45-46
• 2.5 爬片制作46
• 2.6 免疫印迹46
• 3 结果46-48
• 3.1 荧光质粒的鉴定46-47
• 3.2 IFNα和IFNγ的亚细胞定位47
• 3.3 IFNα和IFNγ的免疫印迹47-48
• 4 讨论48-49
• 第六章 鹅Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素的真核表达与鉴定49-53
• 1 材料49
• 1.1 质粒与细胞49
• 1.2 实验试剂49
• 2 方法49-50
• 2.1 引物设计49
• 2.2 产物连接转化49-50
• 2.3 重组质粒鉴定50
• 2.4 质粒转染50
• 2.5 免疫印迹50
• 3 结果50-52
• 3.1 真核表达质粒的鉴定50-51
• 3.3 蛋白的表达鉴定51-52
• 4 讨论52-53
• 第七章 鹅Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素的抗病毒效应研究53-65
• 1 材料53
• 1.1 鸭胚53
• 1.2 细胞与病毒53
• 1.3 主要试剂53
• 1.4 主要仪器53
• 2 方法53-55
• 2.1 GFP荧光强度观察53
• 2.2 病毒基因拷贝数的检测53-54
• 2.3 TCID_(50)的测定54
• 2.4 流式细胞仪的分析54
• 2.5 免疫印迹54
• 2.6 免疫基因的检测54-55
• 3 结果55-63
• 3.1 病毒荧光强度观察55-56
• 3.2 病毒拷贝数检测56-58
• 3.3 病毒滴度检测58
• 3.4 流式细胞仪分析58-59
• 3.5 免疫印迹分析59-60
• 3.6 抗病毒免疫小分子变化规律60-61
• 3.7 剂量依赖的鹅IFNα与IFNγ抗病毒效果61-63
• 4 讨论63-65
• 小结65-66
• 参考文献66-71
• 致谢71

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本文编号：1013711