绵羊Prdx6双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

发布时间：2017-10-12 00:00

  本文关键词：绵羊Prdx6双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

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【摘要】：过氧化物氧还酶6(Peroxiredoxin 6,Prdx6)广泛存在于原核和真核生物的细胞质中。其具有多种生物学功能,例如参与细胞增殖分化、保护自由基敏感蛋白、增强NK细胞的活性、介导哺乳动物细胞信号传导等。主要功能是利用硫氧还原蛋白将过氧化物以及超氧化物进行还原,消除代谢产生的过氧化物。病原微生物侵入生物机体后,能够被吞噬细胞吞噬并导致大量活性氧(ROS)的产生,达到杀灭病原微生物的目的。通过这个过程可以将大部分的病原微生物清除,但是仍然有某些细胞内寄生菌可以逃避吞噬细胞的杀伤作用而存活在细胞内。其中过氧化物氧化还原酶家族(Peroxiredoxins,Prdxs)对ROS的清除可能是胞内寄生菌抵抗ROS氧化损伤作用,得以完成细胞内寄生的重要免疫逃避机制之一。Prdx6是Prdxs家族中的一员,可有效使ROS失活,有可能被胞内寄生菌利用达到清除胞内活性氧完成胞内寄生的目的。此外,近几年研究还发现Prdx6除抗氧化作用外,还与糖尿病、癌症发生发展、脑和肺疾病、以及多种细胞因子的分泌与免疫损伤有关。因此,Prdx6有可能成为某些疾病诊断的生物标志分子。因此建立一种准确、快速检测组织细胞中Prdx6含量的检测方法能够为评估机体健康水平和抗氧化应激能力提供有效工具。布鲁氏菌病(Brucellosis,布病)是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的严重危害公共卫生的人兽共患传染病。本课题组前期研究发现,绵羊白细胞层基因表达谱在布鲁氏菌强毒株感染与疫苗接种两种情况下发生变化。通过Real-time PCR证实,与健康羊相比,自然感染强毒株绵羊白细胞中Prdx6上调表达,而疫苗接种绵羊白细胞Prdx6基因的表达水平与强毒株感染存在差异。推测宿主Prdx6差异表达可能与布鲁氏菌的胞内寄生与增殖存在一定的相关性。本实验建立的检测绵羊Prdx6双抗体夹心酶联免疫吸附分析方法(ELISA),为进一步研究Prdx6在机体疾病发生、发展、转归的标志作用,以及能否用于辅助区别诊断布病自然感染和疫苗免疫提供可应用的检测手段。实验所获得绵羊Prdx6重组蛋白(r Oa Prdx6)纯度较高,抗体效价较高、特异性好,能够用于ELISA反应。通过对ELISA反应各条件优化确定所建方法线性检测范围在8~500ng/m L,标准曲线方程y=1.3349x-0.7978,相关系数R2=0.9946,回收率在94.84%~102.9%。最低检测限为5.95 ng/m L。重复验证ELISA反应结果一致,表明该双抗体夹心ELISA方法的重复性较好。根据优化后的ELISA检测条件,组装绵羊Prdx6双抗体夹心ELISA检测试剂盒。灵敏度高,检测范围在8 ng/m L~500 ng/m L;重复性好,试剂盒同一批次间和不同批次间所得检测结果无明显差异。37℃破坏模拟实验证明试剂盒在4℃条件下保质期一年以上。利用所建立的方法检测临床实际采集的绵羊抗凝血样本白细胞中Prdx6含量,并对检测结果进行统计学分析。对部分羊白细胞Prdx6含量进行ROC曲线分析,初步获得布病疫苗免疫羊与未免疫羊Prdx6含量临界值是31.9 ng/m L,该浓度下诊断敏感度为0.711,特异性为0.739,Youden指数最大为0.45。由于临床实际样本来源有限,布病患病、疫苗免疫与健康未免疫羊临床样品还需进一步准确采集,因此本研究所建立的绵羊Prdx6双抗体夹心ELISA检测方法能否用于布病疫苗免疫与自然感染的辅助性区别鉴定还需进一步研究。但是,本研究所建方法能够检测绵羊外周血白细胞中Prdx6的含量,具有较好的灵敏性和特异性,所组装试剂盒灵敏性和重复性较好,货架期一年,可用于相关的科学研究与应用。
【关键词】：绵羊 Prdx6 ELISA 试剂盒 样本检测
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文缩写词表9-12
• 前言12-14
• 第一部分 文献综述14-22
• 第一章 Prdx6研究进展14-19
• 1 Prdxs蛋白家族14-16
• 2 Prdx6结构与功能16-17
• 3 Prdx6检测意义17-18
• 4 Prdx6诊断方法概述18-19
• 第二章 布病流行现状及诊断概述19-22
• 1 布鲁氏菌病19
• 2 绵羊布鲁氏菌病诊断方法研究进展19-22
• 第二部分 实验研究22-70
• 第三章 绵羊Prdx6重组蛋白和抗体的制备与分析22-36
• 1 材料与方法22-31
• 2 结果与分析31-34
• 3 讨论34-35
• 4 小结35-36
• 第四章 绵羊Prdx6 ELISA检测方法的建立36-46
• 1 材料与方法36-39
• 2 结果与分析39-43
• 3 讨论43-45
• 4 小结45-46
• 第五章 绵羊Prdx6双抗体夹心ELISA检测试剂盒的组装46-56
• 1 材料与方法46-48
• 2 结果48-55
• 3 讨论55
• 4 小结55-56
• 第六章 OaPrdx6 ELISA方法临床血液样本检测与分析56-70
• 1 材料与方法56-59
• 2 结果59-67
• 3 讨论67-69
• 4 小结69-70
• 结论70-71
• 参考文献71-76
• 作者简介76-77
• 致谢77

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本文编号：1015481