检测鸭坦布苏病毒血清抗体的胶体金免疫层析试纸条研制

发布时间：2017-10-12 03:42

本文关键词：检测鸭坦布苏病毒血清抗体的胶体金免疫层析试纸条研制

【摘要】：本研究通过对CQWl株(GenBank登录号：KM233707.1)鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)进行纯化、形态结构观察后,将纯化病毒灭活、免疫健康雏麻鸭,获得鸭抗DTMUV的免疫血清；以此病毒株的核酸为模板,RT-PCR扩增具有较强免疫原性的E基因,并采用原核表达系统对其进行体外表达：基于E基因表达的重组蛋白,首次建立了快速检测DTMUV血清抗体的胶体金免疫层析试纸条。研究的主要内容归结如下：1. DTMUV的纯化、形态学观察及其高免血清制备将CQW1分离株病毒接种9日龄的健康鸭胚,收集接种48 h后死亡鸭胚的尿囊液。采用蔗糖密度梯度(60%、45%和30%)离心纯化DTMUV,透射电镜观察病毒粒子的形态结构。结果显示,在45%-60%蔗糖交界层,镜下可见较多的纯净病毒粒子,大小约为50nm,具有核心、囊膜和突起结构。将纯化的病毒经甲醛灭活,制得免疫抗原后接种健康雏鸭,双向琼脂扩散试验测定免疫鸭血清效价,获得效价为1:32的鸭抗DTMUV血清,为后续实验奠定了基础。2. DTMUV截短E基因的克隆与表达将CQW1分离株的E基因序列进行生物信息学分析,截去其跨膜区并选取免疫原性较强的基因片段设计特异性引物,RT-PCR扩增截短E基因,将其克隆至pET-32a(+)载体后转入E. coli Rosetta(DE3)表达菌进行诱导表达与分析。结果表明,扩增的截短E基因片段经测序分析为1206 bp,与预期结果一致；重组菌经IPTG诱导,成功表达出大小约65 KDa的重组E蛋白；Western-blot分析,发现该蛋白与抗DTMUV鸭血清有特异性反应,表明其具有免疫学活性。3.快速检测DTMUV血清抗体的胶体金免疫层析试纸条建立与应用将胶体金溶液分别标记重组E蛋白和羊抗鼠IgG,并以E蛋白作为检测线,鼠IgG作为质控线,制备可检测DTMUV血清抗体的试纸条。通过试验条件的优化,结果表明,胶体金颗粒与重组E蛋白、羊抗鼠IgG最适标记pH分别约为6.8和6.7;1 mL胶体金溶液的最佳蛋白、羊抗鼠IgG标记量分别为5.5μg和17.0μg。将试纸条分别检测抗DTMUV、抗鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)、抗鸭甲肝病毒3型(Duck hepatitis virus type 3,DHAV-3)、抗鸭乙肝病毒(Duck hepatitis B virus, DHBV)、抗鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV)、抗鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)、抗大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)和抗肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, SE)鸭血清,结果显示仅检测抗DTMUV鸭血清的试纸条为阳性。用试纸条检测经1:2’、1:22......1:210稀释后的鸭抗DTMUV血清,结果显示,该试纸条可检测1:28稀释的血清。采用该试纸条和文献报道的ELISA方法同时检测217份临床鸭血清样品,分析表明,两种方法的检测符合率达到97.24%。
【关键词】：鸭坦布苏病毒 E基因 克隆表达 血清抗体 胶体金免疫层析技术
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

中文摘要3-5
ABSTRACT5-7
缩略词表7-12
第一部分文献综述及选题背景12-17
1 鸭坦布苏病毒概述12-13
2 鸭坦布苏病的检测13-14
3 胶体金免疫层析技术14-16
3.1 GICA原理简介14-15
3.2 GICA在动物病毒检测方面的应用15-16
4 选题意义16-17
第二部分试验研究17-56
第一章鸭坦布苏病毒的纯化、形态学观察及其高免血清制备18-24
1 材料18-19
1.1 毒株与动物18
1.2 主要仪器18
1.3 主要试剂18
1.4 溶液配制18-19
2 方法19-20
2.1 病毒增殖19
2.2 病毒纯化19
2.2.1 病毒浓缩19
2.2.2 蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒19
2.3 病毒形态学观察19-20
2.4 病毒含量测定20
2.5 鸭抗DTMUV免疫血清制备20
2.5.1 免疫抗原的制备20
2.5.2 免疫程序20
2.5.3 效价测定20
3 结果20-22
3.1 病毒纯化20-21
3.2 病毒形态学观察21
3.3 病毒含量测定21-22
3.4 抗体效价测定22
4 讨论22-23
5 小结23-24
第二章鸭坦布苏病毒截短E基因的克隆表达24-36
1 材料24-26
1.1 毒株、菌株24
1.2 主要仪器24
1.3 主要试剂24-25
1.4 溶液配制25-26
1.4.1 琼脂糖凝胶电泳溶液25
1.4.2 SDS-PAGE电泳溶液25
1.4.3 Ni柱亲和层析溶液25-26
1.4.4 免疫印迹溶液26
2 方法26-31
2.1 引物设计26
2.2 目的基因扩增26-27
2.2.1 DTMUV总RNA提取26
2.2.2 cDNA的合成26
2.2.3 目的E基因的PCR扩增26-27
2.2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳27
2.2.5 PCR产物回收纯化27
2.3 目的E基因TA克隆27-28
2.3.1 连接反应27
2.3.2 大肠杆菌感受态细胞制备27
2.3.3 连接产物的转化27
2.3.4 重组质粒pGM-T-E抽提27
2.3.5 重组质粒pGM-T-E酶切鉴定27-28
2.4 原核表达重组质粒构建28-29
2.4.1 双酶切与胶回收28
2.4.2 连接反应28
2.4.3 连接产物的转化28
2.4.4 重组表达质粒pET-32a-E鉴定28-29
2.5 重组表达质粒诱导表达29-30
2.5.1 重组质粒pET-32a-E的转化29
2.5.2 重组质粒pET-32a-E的诱导表达29
2.5.3 SDS-PAGE电泳29
2.5.4 表达条件优化29-30
2.6 原核重组蛋白纯化30
2.6.1 重组蛋白可溶性分析30
2.6.2 重组蛋白的纯化30
2.6.3 重组蛋白复性和浓缩30
2.7 Western-blot分析30-31
3 结果31-34
3.1 截短E基因PCR扩增31
3.2 重组表达质粒构建31-32
3.3 重组表达质粒诱导表达32-33
3.3.1 pET-32a-E的诱导表达32
3.3.2 pET-32a-E表达条件优化32-33
3.4 重组蛋白纯化33-34
3.4.1 可溶性分析33
3.4.2 蛋白纯化33-34
3.5 Western-blot分析34
4 讨论34-35
5 小结35-36
第三章检测鸭坦布苏病毒血清抗体的胶体金免疫层析试纸条的研制与应用36-56
1 材料36-37
1.1 血清36
1.2 主要仪器36
1.3 主要试剂和材料36-37
1.4 主要溶液配制37
2 方法37-42
2.1 玻璃器皿处理37
2.2 胶体金溶液质量鉴定37-38
2.2.1 肉眼观察37
2.2.2 紫外扫描鉴定37-38
2.2.3 胶体金稳定性鉴定38
2.3 金标E蛋白制备38-39
2.3.1 重组E蛋白预处理38
2.3.2 胶体金溶液的准备38
2.3.3 胶体金标记重组E蛋白最适pH值选择38-39
2.3.4 胶体金标记E蛋白最适量的选择39
2.4 金标羊抗鼠IgG制备39
2.5 免疫胶体金鉴定和纯化39-40
2.5.1 免疫胶体金鉴定39-40
2.5.2 免疫胶体金的纯化40
2.6 胶体金试纸条初步组装及鉴定40
2.7 试纸条反应条件优化40-41
2.7.1 试纸条组成材料选择40-41
2.7.2 金标复合物稀释液和稀释倍数选择41
2.7.3 检测线和质控线包被浓度优化41
2.8 免疫层析试纸条性能测定41-42
2.8.1 特异性试验41
2.8.2 敏感性试验41-42
2.8.3 重复性试验42
2.8.4 对比试验42
2.8.5 稳定性试验42
3 结果42-53
3.1 胶体金溶液质量鉴定42-43
3.2 金标E蛋白制备43-45
3.2.1 金标E蛋白最适标记pH选择43-44
3.2.2 金标E蛋白最适蛋白标记量选择44-45
3.3 金标羊抗鼠IgG制备45-46
3.3.1 金标羊抗鼠IgG最适标记pH选择45
3.3.2 金标羊抗鼠IgG最适抗体标记量选择45-46
3.4 免疫胶体金的鉴定46
3.5 试纸条初步组装及鉴定46-47
3.6 试纸条反应条件的优化47-51
3.6.1 层析膜的选择47-48
3.6.2 金标垫的选择48-49
3.6.3 样品垫的选择49
3.6.4 吸收垫的选择49
3.6.5 金标复合物稀释液和稀释倍数的选择49-50
3.6.6 检测线和质控线包被浓度优化50-51
3.7 免疫层析试纸条的性能测定51-53
3.7.1 特异性试验51
3.7.2 敏感性试验51
3.7.3 重复性试验51-52
3.7.4 对比试验52
3.7.5 稳定性试验52-53
4 讨论53-54
5 小结54-56
结论56-57
参考文献57-65
致谢65-66
个人简历及完成的学术论文目录66

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