松辽黑猪肠道内容物及粪便总DNA提取方法对比研究及其盲肠微生物多样性分析

发布时间：2017-10-12 15:34

  本文关键词：松辽黑猪肠道内容物及粪便总DNA提取方法对比研究及其盲肠微生物多样性分析

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【摘要】：肠道微生物与宿主健康息息相关。肠道内微生物的群落结构变化直接影响着宿主的健康和畜牧业的生产效率。断奶后仔猪的肠道菌群结构极不稳定,容易发生应激反应,严重时可导致腹泻和死亡。低剂量抗生素的长期使用能够降低断奶后仔猪的应激反应和腹泻率,提高生产效率,但是抗生素长期使用也具有潜在的危害,如抗生素残留、抗生素对肠道菌群及宿主健康的负面影响等,因此开发抗生素替代物意义重大。而无论是抗生素,还是抗生素替代物,肠道微生物都是其重要的作用靶点。抗生素替代物对肠道微生物的影响是评价其对抗生素替代作用的重要指标之一。肠道微生物种类繁多,肠道内容物组成复杂。总DNA的提取对于肠道微生物群落结构变化、肠道微生物多样性分析等相关研究至关重要。因此,在利用各种分子生物学技术研究肠道微生物时首先需要一种较为合适的总DNA提取方法。六神曲是由青蒿、辣蓼、苍耳、苦杏仁、赤小豆、麦麸和面粉按一定比例混合经自然发酵而成的曲剂,富含多种酶,如蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等,具有消食化积、健脾开胃、和中止泻等功能。益生菌具有维持肠道正常微生物菌群、提高免疫力、提高营养物质的消化吸收等功能。六神曲复合益生菌饲料添加剂具有益生菌、中草药和酶制剂三者共同的特性,作为抗生素替代物开发潜力巨大。本研究首次以松辽黑猪为研究对象,利用PCR-DGGE和实时定量PCR技术分析比较了5种提取方法的有效性,并在此基础上解析了六神曲复合益生菌饲料添加剂和抗生素对松辽黑猪仔猪生长性能及其盲肠微生物多样性的影响。主要结论如下:1、5种方法提取松辽黑猪仔猪盲肠内容物和粪便中总DNA的有效性明显不同采用5中不同的提取方法提取松辽黑猪仔猪盲肠内容物和粪便中总DNA,研究结果显示:QIAamp?DNA Stool Mini Kit提取得到的DNA纯度、得率和所反映的微生物多样性最高,更适合用于松辽黑猪盲肠内容物和粪便中总DNA提取及其微生物多样性分析。TIANamp Stool DNA Kit和SDS高盐提取法提取得到的DNA纯度、得率和所反映的微生物多样性较低;索莱宝粪便基因组DNA提取试剂盒和TZ裂解液提取法提取得到的DNA纯度和得率最差,微生物多样性最低,不适合用于肠道微生物总DNA提取。2、松辽黑猪仔猪盲肠内容物的微生物群落结构、组成与粪便中的差异明显采用同种方法提取同一仔猪的盲肠内容物和粪便中的总DNA,利用PCR-DGGE和实时定量PCR技术分析其微生物群落结构及组成,结果表明:盲肠内容物和粪便微生物群落结构不同,粪便中微生物丰富度高于盲肠内容物。盲肠内容物和粪便中微生物主要属于厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria);实时定量PCR结果表明:盲肠内容物和粪便中微生物群体数量存在差异。因此,在研究肠道微生物时,充分了解盲肠内容物和粪便中微生物群落结构的差异,对动物的防病和促生长具有指导意义。3、六神曲复合益生菌饲料添加剂可部分替代饲用抗生素本研究采用对比饲喂的方法,研究了不同饲料添加剂对仔猪生长性能的影响,研究结果显示:仔猪起始体重一致,但经过不同饲料添加剂饲喂49天后,不同处理组体重差异显著(p0.05),抗生素组较对照组提高40.63%,六神曲组较对照组提高21.73%;不同处理组平均日增重差异显著(p0.05),抗生素组是对照组的2.09倍,六神曲组是对照组的1.59倍;饲料转化率六神曲组和抗生素组高于对照组;六神曲组和抗生素组仔猪严重腹泻和死亡率低于对照组,且六神曲组没有仔猪死亡。六神曲复合益生菌饲料添加剂具有促进仔猪生长,提高仔猪平均日增重和饲料转化率,降低仔猪严重腹泻和死亡率,具有替代饲用抗生素的潜能。4、六神曲复合益生菌饲料添加剂可改善仔猪盲肠微生物组成不同饲料添加剂对盲肠微生物多样性的影响,研究结果显示:盲肠内容物和粘液层微生物组成和相对含量有差异。六神曲复合益生菌饲料添加剂能够提高仔猪盲肠中乳酸杆菌(Lactobacilli spp.),粪肠球菌(Enterococcus spp.)和嗜热链球菌(Streptococcus spp.)群体数量及厚壁菌门与拟杆菌门比例,降低肠杆菌科(Enterobacteriaceae)相对含量和大肠杆菌(Escherichia coli)群体数量,改善仔猪盲肠微生物组成、提高仔猪免疫力。
【关键词】：松辽黑猪 肠道微生物 DNA提取方法 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 实时定量PCR 盲肠内容物 粪便
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 绪论13-27
• 1.1 松辽黑猪的研究概况13-14
• 1.2 肠道微生物14-18
• 1.2.1 肠道微生物与动物健康14-15
• 1.2.2 猪肠道微生物15-18
• 1.3 饲料添加剂18-20
• 1.3.1 抗生素18-19
• 1.3.2 中草药19-20
• 1.3.3 益生菌20
• 1.4 分子生物学技术在肠道微生物研究中的应用20-24
• 1.4.1 变性梯度凝胶电泳技术21-22
• 1.4.2 实时定量PCR技术22-24
• 1.5 肠道微生物总DNA提取方法24-26
• 1.5.1 传统DNA提取方法24-25
• 1.5.2 商品试剂盒提取方法25
• 1.5.3 肠道微生物总DNA提取方法研究现状25-26
• 1.6 本研究目的与意义26-27
• 第二章 盲肠内容物和粪便中微生物总DNA提取方法比较27-62
• 2.1 前言27-28
• 2.2 实验材料与仪器28-34
• 2.2.1 主要材料和试剂28-33
• 2.2.2 主要仪器33-34
• 2.3 实验方法34-37
• 2.3.1 总DNA的提取34-35
• 2.3.2 总DNA的纯度和得率35
• 2.3.3 巢式PCR-DGGE分析35-36
• 2.3.4 实时定量PCR分析36-37
• 2.4 数据分析37
• 2.5 核酸登录号37-38
• 2.6 结果与分析38-59
• 2.6.1 五种DNA提取方法技术特征比较38
• 2.6.2 五种DNA提取方法在盲肠内容物微生物总DNA提取上的应用38-49
• 2.6.3 五种DNA提取方法在粪便微生物总DNA提取上的应用49-56
• 2.6.4 盲肠内容物和粪便中微生物多样性对比分析56-59
• 2.7 讨论59-61
• 2.8 本章小结61-62
• 第三章 松辽黑猪仔猪生长性能及其盲肠微生物多样性分析62-79
• 3.1 前言62-63
• 3.2 实验材料与仪器63-65
• 3.2.1 主要材料和试剂63-65
• 3.2.2 主要仪器65
• 3.3 实验方法65-67
• 3.3.1 六神曲的制备65
• 3.3.2 益生菌菌粉的制备65
• 3.3.3 六神曲和益生菌混合制剂的制备65
• 3.3.4 仔猪饲养管理65-66
• 3.3.5 仔猪生长性能指标66
• 3.3.6 盲肠内容物和粘液层中微生物总DNA的提取66-67
• 3.3.7 盲肠内容物和粘液层中微生物的巢式PCR-DGGE分析67
• 3.3.8 盲肠内容物和粘液层中微生物的实时定量PCR分析67
• 3.4 数据分析67
• 3.5 核酸登录号67
• 3.6 结果与分析67-76
• 3.6.1 仔猪生长性能67-70
• 3.6.2 盲肠微生物多样性分析70-76
• 3.7 讨论76-78
• 3.8 本章小结78-79
• 第四章 总结与展望79-82
• 4.1 总结79-80
• 4.2 展望80-82
• 参考文献82-90
• 作者简介和攻读学位期间主要研究成果90-91
• 致谢91

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本文编号：1019535